Βιοχημική και ανοσοχημική μελέτη του βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος ασθενών με σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS): ανάπτυξη φθορισμομετρικής μεθόδου ανίχνευσης ενεργοτήτων φωσφολιπάσης Ας και PAF-ακετυλυδρολάσης σε βιολογικά υγρά

Abstract

The purpose of the present study was the investigation whether biochemical and immunochemical parametres of bronchoalveolar lavage contribute to the evolution processes of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) and the research for prognostic markers of the evolution of the syndrome. In this direction, the aim of the study was: a) To develop and evaluate a fluorimetric method for the screening and differential determination of phospholipase A2 and PAF-acetylhydrolase in Bronchoalveolar Lavage (BAL) fluid and serum, b) to determine the concentration of proteins and phospholipids, markers of inflammatory reaction such as platelet-activating factor (PAF), PLase A2 and cell alterations in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid during the evolution of the acute respiratory distress syndrome (ARDS), c) to investigate the presence and specificity ofautoantibodies in bronchoalveolar lavage fluid from patients with ARDS, d) to determine the biochemical characteristics, the existence of antiphospholipid antibodies and their specificity in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid from a patient with both antiphospholipid antibodies syndrome (APLAS) and ARDS and finally e) to investigate whether protein C affinity chromatography purifies the immunoglobulin G content of biological fluids from lipids. a) In the beginning, we developed a fluorimetric method for the measurement of phospholipase A2 and PAF-AcH activities in biological fluids. Phospholipase A2 was determined using C i2-NBD-PC in the presence of Ca2+, from the slope of the fluorescence enhancement due to the formation of C i2-NBD-fatty acid. PAFacetylhydrolase was determined using C6-NBD-PC, from the slope of the curve due to C6-NBD-fatty acid formation in the absence of Ca2+. The results were confirmed after TLC analysis. The method’s selectivity was evaluated by comparing to radiometric measurements. Light scattering did not interfere and inner filter effect was not observed under our experimental conditions. The effect of pH, temperature, Ca2+ was investigated. Protein caused an increase in the background fluorescence of both NBDPCs. Both NBD-fatty acids’ standard curves exhibited the same slope. Linearity extended at least up to 4.5 nmoles per ml of reaction mixture at the normal pH 7.4. The NBD-fatty acids’ fluorescence remained stable for increasing concentrations of BAL fluid and serumand for BSA up to 100 pg/ml of reaction mixture. Porcine pancreatic PLase A2 showed preference for Ct2-NBD-PC in the presence of Ca2+, while without Ca2+, serum PAF-AcH hydrolysed only C6-NBD-PC. The method is highly sensitive, accurate and reproducible and can be applied for the differential determination of phospholipase A2 and PAFacetylhydrolase activities in BAL fluid and serum. Particularly, this method was used in this study for the measurement of phospholipase A2 activity in BAL fluids from patients with ARDS. b) In 19 mechanically ventilated patients, 9 patients with ARDS and 10 patients without cardiopulmonary disease (controls), BAL was performed during the early, intermediate, and late phases of ARDS. High levels of PAF, PLase A2, an increase inneutrophils and proteins, and quantitative as well as qualitative alterations in phospholipids in BAL fluid were observed in ARDS patients compared to the control group. PAF, proteins, and neutrophils were higher in early ARDS than in intermediate or late ARDS. The surfactant pool increased in the early phase and decreased in the intermediate or late phase of the syndrome. The qualitative alterations of surfactant consisted of reduced phospholipid content in the surfactant structures with good surface properties. Moreover, there was a considerable decrease in the percentage ofphosphatidylcholine and phosphatidylglycerol, followed by an increase in phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and sphingomyelin in all three phases of ARDS compared to the control group. Lyso-phosphatidylcholine was detectable only in late ARDS. All the above factors, undergoing quantitative alterations during the course of ARDS, could have a significant role in the pathogenesis and evolution of the syndrome. c) Afterwards, the presence and specificity of autoantibodies in bronchoalveolar lavage fluid from patients with ARDS was investigated. Bronchoalveolar lavage fluids were first analyzed by electrophoresis and immunoblotting, using anti-immunoglobulin G antibodies in order to detect any eventual immunoglobulin G (IgG). Under theconditions used, IgG were expected to show 2 bands: one for the heavy chains at 50 kDa and one (less labeled) for the light chains at 25 kDa; the band at 50 kDa was observed for all patients and that for 25 kDa was not always visible. High levels of immunoglobulin G towards different phospholipids were detected in BAL of ARDS patients compared to control patients. ELISA antibody binding was observed on different phospholipids. Generally, antibodies bound PS or PG, or, exceptionally PI, but all reacted with PA, probably because the structure and charge of PA is the common part of all anionic phospholipids. No significant reaction was observed with sphingomyelin or with zwitterionic phospholipids PC and PE. A weak binding was observed for cholesterol butnot for esterified cholesterol. Purified antibodies from sepharose-protein G affinity column showed the same preference towards PS and PA phospholipids suggesting that the ajiti-lipid antibodies evidenced in this study, recognize the lipids tested in the absence of any cofactor. These results show that autoantibodies are present in BAL of ARDS patients, they are directed against anionic phospholipids and this may suggest involvement of autoimmune mechanisms in the pathogenesis of surfactant deficiency, or perpetuation^of the inflammatory reaction at the lung parenchyma level.d) The biochemical characteristics, the existence of antiphospholipid antibodies and their specificity in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid from a patient with both antiphospholipid antibodies syndrome (APLAS) and acute respiratory distress syndrome (ARDS) were investigated. Antiphospholipid antibodies were found to be present in BAL fluid from patient with APLAS. Especially anticardiolipin, antiphosphatidylserine and antiphosphatidic acid IgG antibodies (Abs) were detected in high levels in BAL fluid from the patient with APLAS. A quantitative as well as qualitative deficiency of surfactant phospholipids was also observed. e) Finally, during the investigation whether protein G affinity chromatography purifies the immunoglobulin G content of biological fluids from lipids, BAL fluid and serum samples or various lipids bound to bovine serum albumin were loaded on the column. Elution of the retained material was performed with a glycine-HCI buffer solution pH 2.7. The eluent was analysed by HPTLC and SDS-PAGE. Analysis of theneutral lipids detected in the eluent was performed by gas chromatography/mass spectrometry. It was found that all the samples of BAL fluid tested had high amounts of IgGs after protein G-sepharose affinity purification. The lipid profile after polar HPTLC separation, from the recovered IgG fractions of BAL fluids and sera revealed the presence of neutral lipids and trace amounts of polar lipids. The polar lipids migrated to the Rf values of phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylserine (PS). When the lipid extract was developed in the neutral solvent system, only one lipid residue was detected, migrating to the Rf value of cholesterol. Chemical characterization of this compound with mass spectrometry confirmed that it was cholesterol. It was observed that when the BSA-cholesterol standard solution was applied to protein-G- sepharose column andeluted, the eluent contained cholesterol, but not detectable quantities of BSA. 3 mixtures of BSA with increasing concentrations in standard lipids passed through the protein C - sepharose column. The levels of the unbound albumin were continuously monitored with a UV detector. When protein was no more detected, the buffer was changed so as the bound substances to be eluted. The lipid extract of this fraction revealed increasing amounts of the substance with the same Rr to cholesterol. In addition, PC, PS, PG and PE were also detected. In conclusion, the eluted IgG fraction from human serum or BAL, apart from immunoglobulins, contains traces of phospholipids and cholesterol as a major lipid contaminant.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση της συνεισφοράς βιοχημικών και ανοσοχημικών παραμέτρων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL) στη διαδικασία εξέλιξης του Συνδρόμου Οξείας Αναπνευστικής Δυσχέρειας (ARDS) και η ανεύρεση προγνωστικών δεικτών της εξέλιξης της νόσου. Για το σκοπό αυτό έγινε: α) ανάπτυξη και αξιολόγηση μιας φθορισμομετρικής μεθόδου για την ανίχνευση και διαφορικό προσδιορισμό των ενεργοτήτων της φωσφολιπάσης Α2 (PLase Α2) καιPAF-ακετυλυδρολάσης (PAF-AcH) σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και ορρό αίματος, β) προσδιορισμός των πρωτεϊνών, φωσφολιπιδίων, δεικτών φλεγμονώδους αντίδρασης^όπως ο παράγοντας ενεργοποίησης των αιμοπεταλίω ν (PAF), η PLase Α2 και οι μεταβολές των κυττάρων στο BAL κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του ARDS, γ) διερεύνηση της ύπαρξης και εξειδίκευσης αυτοαντισωμάτων κατά φωσφολιπιδίων στο BAL ασθενών με ARDS, δ) προσδιορισμός των βιοχημικών χαρακτηριστικών, ανίχνευση και έλεγχος εξειδίκευσης αντιφωσφολιπιδικών αντισω μάτω ν στο BAL ασθενούς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο και ARDS και τέλος ε) μελέτη εάν ηχρωματογραφία στήλης συγγένειας πρωτεΐνη C καθαρίζει τις ανοσοσφαιρίνες G των βιολογικών υγρών από τα λιπίδια. α) Αρχικά έγινε ανάπτυξη φθορισμομετρικής μεθόδου για μέτρησηενεργότητας PLase Α2 και PAF-AcH σε βιολογικά υγρά. Η PLase Α2 προσδιορίστηκε με τη χρήση της Ο^-ΝΒϋ-φωσφατιδυλοχολίνης παρουσία Ca2+, από την κλίση της καμπύλης αύξησης της έντασης φθορισμού λόγω του σχηματισμού του C 12-N BD - λιπαρού οξέος. Η PAF-AcH προσδιορίστηκε με τη χρήση της C6-NBD φωσφατιδυλοχολίνης, από την κλίση της καμπύλης λόγω του σχηματισμού του C$-NBD-λιπαρού οξέος απουσία Ca2+. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν μετά από ανάλυση TLC. Εκτιμήθηκε η εξειδίκευση της μεθόδου σε σύγκριση με ραδιομετρικό προσδιορισμό. Στις δεδομένες πειραματικές συνθήκες δεν παρατηρήθηκε παρεμβολή από σκέδαση του φωτός ούτε φαινόμενο εσωτερικού φίλτρου. Διερευνήθηκε η επίδραση του pH, της θερμοκρασίας και των ιόντων Ca2+. Οι πρωτεΐνες προκάλεσαν μια αρχική αύξηση του φθορισμού των δύο NBD-PCs. Οι"πρότυπες καμπύλες των NBD-λιπαρών οξέων είχαν όμοια κλίση. Η γραμμικότητα επεκτάθηκε μέχρι τουλάχιστον τα 4.5 nmoles λιπαρού οξέος ανά ml του μίγματος αντίδρασης ae pH 7.4. Ο φθορισμός των NBD-λιπαρών οξέων παρέμεινε σταθερός για αυξανόμενες συγκεντρώσεις του BAL και του ορρού καθώς και για BSA μέχρι τα 100 pg/ml του μίγματος αντίδρασης. Η παγκρεατική PLase Α2 έδειξε προτίμηση στην υδρόλυση της C 12-NBD-PC παρουσία Ca2+, ενώ απουσία Ca2+ η PAF-AcH υδρόλυσε μόνο την C6-NBD-PC. Η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη, ακριβής και επαναλήψιμη καιμπορεί να εφαρμοστεί για το διαφορικό προσδιορισμό της PLase Α2 και της PAF-AcH στο BAL και στον ορρό. Ακολούθως, η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της ενεργότητας PLase Α2 σε BAL ασθενών με ARDS. β) Σε 19 μηχανικά αεριζόμενους ασθενείς με ARDS και 10 ασθενείς χωρίς καρδιοπνευμονική πάθηση (ομάδα ελέγχου), έγινε λήψη BAL κατά τη διάρκεια της πρώιμης, ενδιάμεσης και όψιμης φάσης του ARDS. Υψηλά επίπεδα PAF, PLase Α2, ουδετερόφιλων και πρωτεϊνών καθώς και ποιοτικές και ποσοτικές μεταβολές των φωσφολιπιδίων ανιχνεύθηκαν στο BAL ασθενών με ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Τα επίπεδα του PAF, των ουδετερόφιλων και των πρωτεϊνών βρέθηκαν υψηλότερα στο πρώιμο σε σύγκριση με το ενδιάμεσο ή το όψιμο ARDS. Τα επίπεδα των ολικών φωσφολιπιδίων παρουσίασαν αύξηση στην πρώιμη και μείωση στηνενδιάμεση και όψιμη φάση του συνδρόμου. Ο ι ποιοτικές μεταβολές του επιφανειοδραστικού παράγοντα συνίστανται σε μειωμένα επίπεδα φωσφολιπιδίων στο κλάσμα του επιφανειοδραστικού παράγοντα με καλές επιφανειοδραστικές ιδιότητες. Επιπλέον, υπήρξε μια σημαντική μείωση στο ποσοστό της φωσφατιδυλοχολίνης και φωσφατιδυλογλυκερόλης και αύξηση στηφωσφατιδυλαιθανολαμίνη φωσφατιδυλοσερίνη, φωσφατιδυλινοσιτόλη και σφιγγομυελίνη σε όλες τις φάσεις του ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η λυσο-φωσφατιδυλοχολίνη ήταν ανιχνεύσιμη μόνο στην όψιμη φάση του συνδρόμου. Όλοι οι παραπάνω παράγοντες που μεταβλήθηκαν θα μπορούσαν να έχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση και εξέλιξη της νόσου.γ) Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η παρουσία αυτοαντισωμάτων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών με ARDS. To BAL αναλύθηκε αρχικά με ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του και ανοσοαποτύπωοη των ανοσοσφαιρινών G (IgG) χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινα-lgG αντισώματα. Υπό αυτές τις συνθήκες, οι IgGs εμφάνισαν δύο ζώνες πρωτεϊνών, τις βαριές και ελαφρές (λιγότεροσημασμένες) αλυσίδες των IgG, στα 50 και 25 kDa αντίστοιχα. Η ζώνη στα 50 kDa ανιχνεύθηκε στο BAL όλων των ασθενών με ARDS, ενώ η ζώνη στα 25 kDa δεν ήταν πάντα ορατή. Υψηλά επίπεδα ανοσοσφαιρινών G έναντι διαφόρων φωσφολιπιδίων ανιχνεύθηκαν στο BAL των ασθενών με ARDS σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η δέσμευση των αντισωμάτων του BAL με ELISA παρατηρήθηκε για διάφορα φωσφολιπίδια. Τα αυτοαντισώματα δεσμεύτηκαν με PS ή PG, ή μερικές φορές με ΡΙ, αλλά όλα αντέδρασαν με το φωσφατιδικό οξύ, πιθανώ ς διότι το ΡΑ είναι κοινότμήμα όλων των ανιονικών φωσφολιπιδίων. Δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική δέσμευση με σφιγγομυελίνη ή με PC και ΡΕ. Ασθενής δέσμευση παρουσιάστηκε με τη χοληστερόλη όχι όμως με την εστεροποιημένη χοληστερόλη. Τα καθαρισμένα αντισώματα από στήλη συγγένειας πρωτεΐνης G, παρουσίασαν την ίδια προτίμηση για PS και ΡΑ υποδεικνύοντας ότι αυτά τα αντιλιπιδικά αντισώματα αναγνωρίζουν τα λιπίδια που δοκιμάστηκαν απουσία οποιουδήποτε συμπαράγοντα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι αυτοαντισώματα υπάρχουν στο BAL ασθενών με ARDS και κατευθύνονται κατά των ανιοντικών φωσφολιπιδίων και αυτό μπορεί να υποδηλώνει συμμετοχή αυτοάνοσων μηχανισμών στην παθογένεση της ανεπάρκειας του επιφανειοδραστικού παράγοντα ή διαιώνιση της φλεγμονώδους αντίδρασης στο επίπεδο του πνευμονικού παρεγχύματος. δ) Μελετήθηκαν τα βιοχημικά χαρακτηριστικά, η ύπαρξη και εξειδίκευση αντιφωσφολιπιδικών αντισωμάτων στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενούς με αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο (APLAS) και ARDS. Αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα βρέθηκαν στο BAL ασθενούς με APLAS. Συγκεκριμένα, ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα αντισωμάτων κατά της καρδιολιπίνης, φωσφατιδυλοσερίνης και φωσφατιδικού οξέος. Παρατηρήθηκε επίσης ποιοτική και ποσοτική ανεπάρκεια των φωσφολιπιδίων του επιφανειοδραστικού παράγοντα και αυξημένα επίπεδα ουδετερόφιλων. ε) Κατά τη διάρκεια της μελέτης εάν η στήλη χρωματογραφίας συγγένειας πρωτεΐνης G καθαρίζει τις περιεχόμενες ανοσοσφαιρίνες G βιολογικών υγρών από τα λιπίδια, διάφορα δείγματα BAL και ορρών καθώς και διάφορα λιπίδια δεσμευμένα με αλβουμίνη περάστηκαν από τη στήλη. Η έκλουση του υλικού πουσυγκρατήθηκε από τη στήλη έγινε με ρυθμιστικό διάλυμα γλυκίνης pH 2.7. Βρέθηκε ότι όλα τα δείγματα BAL που δοκιμάστηκαν περιείχαν υψηλά επίπεδα IgG μετά τον χρωματογραφικό καθαρισμό. Στο λιπιδικό εκχύλισμα του κλάσματος των εκλουομένων IgG ανιχνεύθηκαν, μετά από διαχωρισμό HPTLC, ουδέτερα λιπίδια και ίχνη πολικών λιπιδίων. Τα πολικά λιπίδια μετατοπίστηκαν στο Rf της PC και PS, ενώ η ανάλυση τω ν ουδετέρων λιπιδίων έδειξε την παρουσία ενός λιπιδίου που μετατοπίστηκε στο Rf της χοληστερόλης. Χημικός χαρακτηρισμός αυτού του συστατικού με φασματομετρία μάζας απέδειξε ότι ήταν πράγματι η χοληστερόλη. Όταν πρότυπα διαλύματα χοληστερόλης με BSA χρωματογραφήθηκαν από τη στήλη πρωτεΐνης G, βρέθηκε ότι το έκλουσμα περιείχε χοληστερόλη όχι όμως ανιχνεύσιμες με ανάλυση SDS-ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ποσότητες BSA. Όταν αυξανόμενες συγκεντρώσεις μίγματος λιπιδίων σε διάλυμα BSA διαπέρασαν τη στήλη, παρατηρήθηκε ότι το λιπιδικό εκχύλισμα του εκλούσματος με το ρυθμιστικό διάλυματης γλυκίνης pH 2.7 περιείχε αυξανόμενες συγκεντρώσεις χοληστερόλης. Επίσης, ανιχνεύθηκαν σε αυτό PC, PS, PG και ΡΕ. Συμπερασματικά, το κλάσμα των καθαρισμένων IgG δειγμάτων BAL ή ορρών, περιέχει, εκτός από τις ανοσοσφαιρίνες, ίχνη φωσφολιπιδίων και χοληστερόλης ως το κύριο λιπίδιο.