Μοριακή ανάλυση παραγόντων προσαρμοστικότητας του βακτηρίου Zymomonas mobilis σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης

Abstract

Zymomonas mobilis is a strictly ferm entative gram-negative ethanologenic bacterium, which obtains its metabolic energy anaerobically via the Entner-Doudoroff pathway. Z mobilis is an ideal organism fo r studying unclarified aspects of glycolytic flux in conjunction with sugar tolerancemechanisms. Exponentially growing cells of Z mobilis normally have a lag period up to 3 h when transferred from a 2% to a 10% glucose liquid medium. W e have isolated ’ a mutant of Z mobilis, CUlkif2, which exhibited (a) a lag period 10-20 h when transferred to 10% glucose liquid medium, not due to an osmoregulation deficiency and (b) reduced glucose uptake and glucokinase activity.By using a wild type Z mobilis genomic library we isolated a 4,5 kb fragment that complemented the phenotype of CU lRif2. This fragment consists of four ORFs and contains -35 and -10 Z. mobilis promoter elements, indicating that the four O RFs are controlled by a common promoter, named Pgic. The putative promoter activity was verified by subcloning and subsequent expression of reporter genes. Furtherm ore, it was found that the P9|C promoter is subject to induction not specifically by increased sugar or salt concentrations, thus appearing as an osmoregulated promoter. Interestingly, it was proved that the product of ORF4 is interacting with the Pgic promoter, indicating a mechanism of osmoregulated expression. RT-PCR analysis showed that the gene cluster produced a single transcript indicating the organization of an operon, named glc operon. Further transcriptional analysis demonstrated that the operon expression is under thecontrol of the concentration of glucose, hence supporting its direct involvement in the yet uncharacterized glucose tolerance mechanism of Z mobilis. Th e four O RFs were subcioned in the overexpression vector pET29c(+) by PCR cloning. Products of ORF1, O RF2, ORF3 and O RF4 were successfully overexpressed. The sequencing of the cloned O RF4 PCR fragment revealed theabsence of a nucleotide at the position 2271 which created a stop codon 15 bases downstream. The new data slightly changed the genetic organization of the operon in the region of O RF4, as five O RF4s were predicted by the used program analysis. The five O RF4s code the same overlapping protein with identical C-terminal and alternative N-terminal region. The biggest of the fiveO R F4s, O RF4a, is the physiological one as it can restore all of the deficiencies of the mutant strain. Complementation experiments revealed that O RF4 alone could resto re the defective phenotype of CU lRif2. Furthermore, it was found that O R F4 could also restore the glucokinase activity in the mutant strain. The products of ORF1 and O RF2 have been isolated and partiallycharacterized. The protein encoded by ORF1 was found to be 37 kDa and likely to be organized as a dimmer, whereas the protein encoded by ORF2 was rather an examer of 18,8 kDa monomers (120 kDa). ORF1 and ORF2 exhibit strong homology with Isp D and Isp F proteins respectively which are involved in the non-mevalonate DOXP pathway for the biosynthesis of isoprenoids. The productof O RF3 appears to be a novel protein as it showed no homology with any known sequences in all available databases; the product of ORF4 was found homologous with the CinA protein, which is part of the Competence Induced operon (c/h operon), a protein which is thought to be specifically required at some stage in the process of transformation. We've managed to tran sfer plasmid p B Z IP l in Z mo bill's wild type strain ATCC 10988 by chemical transformation, but the plasmid showed structural instability in the new host. Interestingly, we discovered th at the mutation of C U lR if 2 was due to an insertion of 848 bp within O RF4, which could explain its deficiency to grow on a10% glucose medium. The g/c operon from the mutant strain (5.341 bp) has been isolated.Finally, we propose that the growth of Z. mobilis on elevated glucose w· concentrations takes place through a two-component regulatory system.

Το βακτήριο Ζ mobilis, είναι ένα αρνητικό κατά Gram, αιθανολοπαραγωγό βακτήριο, το οποίο χρησιμοποιεί την γλυκολυτική πορεία Entner-Doudoroff. Ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά του βακτηρίου αυτού είναι η ανθεκτικότητά του σε αυξημένες συγκεντρώσεις γλυκόζης μέσω ενός μηχανισμού ο οποίος παραμένει αδιευκρίνιστος. Στην παρούσα εργασία, έγινε προσπάθεια μελέτηςτου μηχανισμού αυτού. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το μεταλλαγμένο στέλεχος CU lRif 2, το οποίο δεν αναπτύσσεται σε στερεό θρεπτικό μέσο που περιέχει 10% γλυκόζη, ενώ σε υγρό θρεπτικό μέσο που περιέχει 10% γλυκόζη, αναπτύσσεται μετά από μία φάση εφησυχασμού 22 ωρών περίπου, χωρίς να υπάρχει πρόβλημα οσμωρύθμισης. Επιπρόσθετα, η πρόσληψη και η φωσφορυλίωση της γλυκόζης δεν φαίνεται να λειτουργεί σωστά στο μεταλλαγμένο στέλεχος όταν η συγκέντρωση της γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο αυξηθεί. Από μία γονιδιακή βιβλιοθήκη του φυσικού τύπου απομονώθηκε ένα τμήμα DNA, το οποίο όταν εκφραστεί στα κύτταρα του στελέχους C U lR if2 αναπληρώνει την ανθεκτικότητά τους σε στερεό και υγρό θρεπτικό μέσο που περιέχει 10%γλυκόζη, καθώς και την σωστή λειτουργία της πρόσληψης και της φωσφορυλίωσης της γλυκόζης.Στην παρούσα εργασία, με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (RT-PCR) βρέθηκε ότι το τμήμα αυτό το οποίο αποτελείται από ένα σύμπλεγμα τεσσάρων γονιδίων, τα ORF1, ORF2, ORF3 και O R F4, συμμεταγράφεται ως ένα αυτόνομο οπερόνιο, το οπερόνιο glc όπως ονομάστηκε και βρίσκεται υπό τον έλεγχο κοινού προαγωγού, του P9ie. Ο προαγωγός Pgic βρέθηκε ότι είναι οσμωρυθμιζόμενος και αλληλεπιδρά με το προϊόν του ORF4 υποδεικνύοντας μια λειτουργία αυτορύθμισης. Επιπρόσθετα βρέθηκε ότι η μεταγραφή του οπερονίου glc ρυθμίζεται από τη συγκέντρωση της γλυκόζης στο θρεπτικό μέσο και μάλιστα η ρύθμιση αυτή γίνεται στο μεταγραφικό επίπεδο. Τα τέσσερα ORFs υποκλωνοποιήθηκαν στον φορέα υπερέκφρασης pET29c(+) και υπερεκφράστηκαν με επιτυχία. Η ανάλυση της αλληλουχίας του O RF4 αποκάλυψε την απουσία του νουκλεοτιδίου στη θέση 2271 που ως αποτέλεσμα έχει τηδημιουργία ενός κωδικονίου τερματισμού (ΤΑΑ) 15 νουκλεοτίδια καθοδικά. Με βάση την εκ νέου ανάλυση της αλληλουχίας του οπερονίου glc, προτείνονται 5 πιθανές περιοχές έναρξης και μία τερματισμού για το ORF4. Από τα δεδομένα της παρούσας διατριβής το φυσιολογικό ORF4 είναι το μεγαλύτερο από τα 5 προτεινόμενα, το ORF4a καθώς έχει την ικανότητα από μόνο του να αναπληρώνει την ανθεκτικότητα του μεταλλαγμένου στελέχους τόσο σε στερεό όσο και σε υγρό θρεπτικό μέσο 107ο γλυκόζης και επιπρόσθετα αποκαθιστά και τη δραστικότητα της γλυκοκινάσης στο μεταλλαγμένο στέλεχος CUlRif2. Οι πρωτεΐνες που κωδικεύονται από τα 0RF1 και 0 R F 2 παρουσιάζουν ισχυρή ομολογία καθώς και εκτεταμένες συντηρημένες περιοχές με τις πρωτεΐνεςIspD και Isp F αντίστοιχα, οι οποίες εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των ισοπρενοειδών μέσω της πορείας της φωσφορικής δεοξυ-ξυλουλόζης (πορεία DOXP). Απομονώθηκαν και καθαρίστηκαν με επιτυχία τα προϊόντα των 0RF1 και 0 R F2. Η πρωτεΐνη του 0RF1 υπολογίστηκε στα 37 kba και εμφανίζεται ως διμερές, ενώ η πρωτεΐνη του 0 R F2 υπολογίστηκε στα 120 kDa και πιθανότατα αποτελεί εξαμερές. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά για απομόνωση των εν λόγω πρωτεϊνών τουΖ mobiUsmb ετερόλογο σύστημα υπερέκφρασης. Δεν βρέθηκε ομολογία της πρωτεΐνης που κωδικεύεται από το 0 R F 3 με γνωστές πρωτεΐνες. Από τα μέχρι σήμερα δεδομένα φαίνεται ότι πρόκειται για μια νέα πρωτεΐνη. Αντίθετα, βρέθηκε ισχυρή ομολογία καθώς και εκτεταμένεςσυντηρημένες περιοχές μεταξύ της πρωτεΐνης που κωδικεύεται από το O RF4 και της πρωτεΐνης CinA (Competence-damaged protein). Η πρωτεΐνη CinA είναι η πρώτη που κωδικεύεται από το οπερόνιο tin (competence-inducible operon) και θεωρείται ότι απαιτείται σε κάποια φάση κατά την διάρκεια του μετασχηματισμού ορισμένων βακτηρίων όπως 5. pneumoniae, Β. subtilis και ΰ. radiodurans. Επετεύχθη μεταφορά του πλασμιδίου ρΒ ΖΙΡΙ στο φυσικό στέλεχος του Ζ. mobilis A TCC 10988 με χημικό μετασχηματισμό, όμως το μεταφερόμενο πλασμίδιο παρουσίασε δομική αστάθεια στο νέο ξενιστή. Εντοπίστηκε η μετάλλαξη στο οπερόνιο g!c στο μεταλλαγμένο στέλεχοςC U lR if2. Ένθεση χρωμοσωμικής προελεύσεως, μεγέθους 848 bp, εισήχθη στην περιοχή του O RF4. Το εύρημα αυτό πιθανόν να εξηγεί την αδυναμία του CU1 και των παραγωγών του (C U lR if2) να αναπτύσσονται σε αυξημένες συγκεντρώσεις γλυκόζης. Επιπρόσθετα, απομονώθηκε από το CU lR if 2 το οπερόνιο glc μεγέθους 5.341 bp. Τέλος, με βάση τα δεδομένα της παρούσας διατριβής προτείνεται ένα θεωρητικό μοντέλο για την ανθεκτικότητα του Ζ. mobilis at αυξημένες συγκεντρώσεις γλυκόζης. Σύμφωνα με αυτό η ανθεκτικότητα είναι αποτέλεσμα ενός ρυθμιστικού συστήματος δύο συστατικών.