Σύγκριση επιπέδων τελομεράσης σε ασθενείς με λοίμωξη από τους ιούς ηπατίτιδας Β & C

Abstract

Telomeres are the natural ends of chromosomes, where the “end replication problem” takes place. This problem leads to the loss of 20-200bp from each chromosome after each cell division. The role of telomerase, an RNA-dependent DNA polymerase is to maintain the ends of chromosomes, so telomere lengths are extended or maintained and replicative senescence is avoided. Telomerase consists of two essential components: one is the functional RNA component hTR) which serves as a template for telomeric DNA synthesis and the other is a catalytic protein (hTERT) with reverse transcriptase activity. While most normal human somatic cells exhibit no detectable telomerase activity, highly proliferative cells such as germline cells, trophoblasts, hematopoietic cells, endometrial cells, and up to 85-90% of cancer cells, including hepatocellular carcinoma. The transcriptional regulation of hTERT expression depends on transcriptional factors that bind to the hTERT promoter and also on epigenetic mechanisms. DNA promoter methylation is one of the main epigenetic mechanisms that controls hTERT expression, due to the large number of CpG sites that are found in the promoter, though the role of DNA methylathion in hTERT regulation has not been elucidated yet. Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumours worldwide. The major clinical risk factor for HCC development is chronic viral hepatitis, since 70–90% of HCCs develop in a HBV or HCV-related cirrhotic liver. It has been thought that chronic viral hepatitis provides the mitogenic and mutagenic environment that can cause the malignant transformation of hepatocytes. This may result in genetic alterations, such as activation or inactivation of several genes. hTERT is one of the genes that could be used for the construction of the “molecular profile” of patients suffering from chronic viral hepatitis. The main research of this thesis was the correlation of hTERT expression in chronic viral hepatitis tissues with the expression in normal and HCC liver tissues and the investigation of a mechanism that regulates hTERT expression. Three groups of patients were used: patients with chronic HBV and HCV infections, patients without liver disease which consisted the control group of the study and patients with histologically proven HCC. DNA and RNA were isolated from peripheral blood mononuclear cells and liver tissue biopsies. TRAP assay was performed to measure telomerase activity and real time PCR was used to quantify hTERT expression. Moreover, real time PCR and sequencing was used to determine the methylation status of hTERT promoter, in order to address the main factor that regulates hTERT expression in hepatocytes. The expression of hTERT transcripts in peripheral blood mononuclear cells was found to be significantly lower in the HBV and HCV patients compared to healthy controls and was not associated with the type of viral infection, the clinical status of the patients, age, sex, or aminotransferase levels. The presence of low levels of hTERT mRNA suggest the involvement of the catalytic subunit of telomerase in the immunopathogenesis of chronic hepatitis B and C since the decreased levels of hTERT mRNA expression represent a sign of premature aging of the immune system. Telomerase activity and hTERT expression was found high in all liver tissues of patients with HCC, while all normal liver tissues showed no telomerase activity and hTERT expression. This shows that hTERT mRNA overexpression in human liver tissues might be one of the processes involved in the multistep carcinogenesis of the liver. Additionally, we determined telomerase activity in liver tissues from patients with chronic viral hepatitis and observed that 15.6% of the specimens had detectable, although significantly lower than that observed in HCC cases- telomerase activity. Moreover, liver tissues from patients with chronic hepatitis B and C exhibit hTERT mRNA expression, associated with longer disease duration. Taking into account the above mentioned it can be suggested that patients with chronic viral hepatitis that demonstrated significant telomerase activity and increased hTERT mRNA levels on their tissues would require a careful and close follow-up for the potential development of HCC. We found that hTERT promoter region was highly methylated in normal liver tissues while in chronic viral hepatitis and HCC tissues was not methylated and highly expressed. Methylathion of CpG sites in hTERT promoter inhibits transcription factors (such as c-myc protein) to bind to the promoter and enhance transcription. Furthermore we have shown that hTERT methylation status is a prognostic marker of hepatocellular carcinomas progression and survival rate. Patients with very low PMR (percent of methylated reference) values had worse prognosis than patients with high PMR values. The use of methylathion status of hTERT promoter as a prognostic marker in patients with chronic viral hepatitis requires longer follow-up and the assessment of more clinical data.

Τα τελομερή αποτελούν τα φυσικά άκρα των γραμμικών χρωμοσωμάτων στα οποία παρουσιάζεται το λεγόμενο «πρόβλημα ολοκλήρωσης της αντιγραφής». Αποτέλεσμα του συγκεκριμένου προβλήματος είναι, σε κάθε διαίρεση, τα χρωμοσώματα να χάνουν περίπου 20-200 ζεύγη βάσεων από τα τελομερή τους. Η τελομεράση είναι μία RNA-εξαρτώμενη DNAπολυμεράση, η οποία διατηρεί το μήκος των τελομερών παρέχοντας στα κύτταρα τη δυνατότητα για απεριόριστο αριθμό διαιρέσεων. Αποτελείται από δύο υπομονάδες, την RNA(hTR) και την καταλυτική υπομονάδα (hTERT), η οποία έχει δράση αντίστροφης μεταγραφάσης, ενώ υπάρχουν και πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την τελομεράση συμβάλλοντας στη δημιουργία ενός ενεργού ολοενζύμου. Η δραστικότητα της τελομεράσης καταστέλλεται κατά την εμβρυϊκή διαφοροποίηση στα περισσότερα σωματικά κύτταρα. Ωστόσο, παρατηρείται έκφραση σε ορισμένους τύπους κυττάρων, όπως για παράδειγμα σε αιμοποιητικά αρχέγονα κύτταρα, σε αναπαραγωγικά κύτταρα, σε ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα, σε κύτταρα του μυελού των οστών κ.ά. Επιπλέον, έχει βρεθεί έκφραση του ενζύμου σε 85-90% των περιπτώσεων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (ΗKK). Η μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου hTERT, από την οποία εξαρτάται η δράση της τελομεράσης, και στην οποία κατέχει κεντρικό ρόλο η ρυθμιστική περιοχή του υποκινητή, πραγματοποιείται τόσο μέσω μεταγραφικών παραγόντων όσο και μέσω επιγενετικών μηχανισμών. Mεταξύ των επιγενετικών μηχανισμών που ελέγχουν την έκφραση του γονιδίου hTERT κυριαρχεί η μεθυλίωση του DNA, λόγω της παρουσίας μεγάλου αριθμού νησίδων CpG εντός του υποκινητή. O τρόπος με τον οποίο η μεθυλίωση επηρεάζει την έκφραση του hTERT αποτελεί αντικείμενο έρευνας των τελευταίων ετών και δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί ακόμη. Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (ΗKK) αποτελεί έναν από τους πιο συνήθεις κακοήθεις όγκους παγκοσμίως. O κυριότερος παράγοντας πρόκλησης του ΗKK είναι οι χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες και έχει βρεθεί ότι το 70-90% των ατόμων που θα αναπτύξουν κίρρωση θα αναπτύξουν τελικά και ΗKK. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η χρόνια ηπατίτιδα B και Cπροσφέρει τόσο το μιτογόνο όσο και το μεταλλαξογόνο περιβάλλον το οποίο είναι σε θέση να προκαλέσει την τροποποίηση του γενετικού υλικού των ηπατοκυττάρων. Mεταξύ των μηχανισμών που ενέχονται στην τροποποίηση του γενετικού υλικού των ηπατοκυττάρων συγκαταλέγονται η ενεργοποίηση καθώς και η απενεργοποίηση διάφορων γονιδίων. Το γονίδιο hTERT συγκαταλέγεται μεταξύ των γονιδίων τα οποία θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή του «μοριακού προφίλ» των ασθενών με χρόνιεςιογενείς ηπατοπάθειες. Mε βάση τα παραπάνω, το πεδίο έρευνας της συγκεκριμένης διατριβής αποτελεί η συσχέτιση της έκφρασης της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης σε ιστούς με χρόνιες ιογενείςηπατοπάθειες τόσο με την αντίστοιχη σε υγιείς και καρκινικούς ιστούς όσο και με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους, καθώς και η διερεύνηση του μηχανισμού ρύθμισης της έκφρασης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν 3 ομάδες ασθενών: άτομα που δεν εμφάνιζαν καμία ηπατοπάθεια και αποτελούσαν την ομάδα ελέγχου, άτομα με χρόνια ιογενή ηπατίτιδα και άτομα με ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Από τα άτομα αυτά απομονώθηκε DNA και RNA τόσο από περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα όσο και από ιστούς ήπατος. Mε το ημιποσοτικό πρωτόκολλο πολλαπλασιασμού των τελομερικών επαναλήψεων υπολογίστηκε η δραστικότητα της τελομεράσης, ενώ με την χρήση ποσοτικής PCR εντοπίστηκαν τα επίπεδα του hTERT mRNA. Επιπλέον, με την χρήση ποσοτικής PCR αλλά και με την εύρεση της αλληλουχίας των βάσεων διερευνήθηκε αν και με ποιον τρόπο ο επιγενετικός μηχανισμός της μεθυλίωσης ρυθμίζει την έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης στα ηπατοκύτταρα. Όσον αφορά στην ποσοτικοποίηση της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης (hTERT) στα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα, διαπιστώθηκε σημαντική μείωση στα επίπεδα των hTERT mRNA μεταγράφων στα συγκεκριμένα κύτταρα των ασθενών με χρόνια HBV και HCV λοίμωξη σε σχέση με τους υγιείς, ενώ τα επίπεδα της hTERT ήταν ανεξάρτητα από την κλινική κατάσταση των ασθενών, την ηλικία, το φύλο, τη διάρκεια της νόσου και τα επίπεδα των αμινοτρανσφερασών. Τα μειωμένα επίπεδα της έκφρασης του hTERT mRNA αποτελούν σημείο πρώιμης γήρανσης του ανοσοποιητικού συστήματος και προτείνεται ότι η hTERTσυμμετέχει στην ανοσολογική δυσλειτουργία των ασθενών με χρόνια HBV και HCV λοίμωξη. Τα ευρήματα που προέκυψαν από την μέτρηση της δραστικότητας της τελομεράσης και την ποσοτικοποίηση της έκφρασης της καταλυτικής υπομονάδας της τελομεράσης φανέρωσαν ότι όλα τα υγιή ηπατοκύτταρα δεν παρουσιάζουν έκφραση τελομεράσης και hTERT mRNA, σε αντίθεση με όλα τα κύτταρα που προέρχονται από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα τα οποία εμφανίζουν μέγιστες τιμές έκφρασης τελομεράσης και hTERT mRNA. Στις χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες, οι οποίες είναι μη καρκινικές καταστάσεις, δεν θα αναμενόταν έκφραση τελομεράσης. Παρόλα αυτά, είναι σημαντικό ότι το 15.6% των ιστών με χρόνια ιογενή ηπατίτιδα βρέθηκε να παρουσιάζει χαμηλή αλλά σημαντική δραστικότητα τελομεράσης καθώς και έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας hTERT. Η υπερέκφραση του hTERTmRNA και η αυξημένη δραστικότητα της τελομεράσης στο ήπαρ των ατόμων που πάσχουν από ΗKK επιτρέπει στο ηπατοκύτταρο ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και καταλήγει να είναι ένας από τους παράγοντες που οδηγούν στην ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Επιπρόσθετα, στους ασθενείς με χρόνιες ιογενείς ηπατοπάθειες τα επίπεδα του hTERTmRNA βρέθηκαν υψηλότερα στα άτομα που εμφάνισαν μεγαλύτερη διάρκεια της νόσου. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό και με τα παραπάνω συμπεράσματα επιβάλλει την προσεκτικότερη παρακολούθηση της πορείας της νόσου στα άτομα που εμφανίζουν χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια και ταυτόχρονα παρουσιάζουν έκφραση τελομεράσης και hTERT mRNAσε βιοψίες ήπατος, θεωρώντας ότι αυτή η υποκατηγορία ασθενών ίσως να έχει μεγαλύτερη πιθανότητα ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Η διερεύνηση του μηχανισμού που ελέγχει την έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας, επικεντρώθηκε στην επιγενετική ρύθμιση της hTERT μέσω της μεθυλίωσης του DNA. Τα αποτελέσματα της διατριβής φανέρωσαν ότι η πλήρης μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου hTERT στα κύτταρα του ήπατος, εμποδίζει την σύνδεση μεταγραφικών παραγόντων και αναστέλλει την έκφρασή του, γεγονός που παρατηρείται σε υγιείς ιστούς και σε ένα ποσοστό ιστών με χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια. Αντιθέτως, σε ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών με χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια και σε όλους τους ασθενείς με ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα εμφανίζεται μη μεθυλιωμένος ή με μικρά ποσοστά μεθυλίωσης ο υποκινητής του γονιδίου hTERT. Για πρώτη φορά αποδείχθηκε ότι το ποσοστό της μεθυλίωσης σχετίζεται με την έκφραση του γονιδίου hTERT σταηπατοκύτταρα, αλλά και ότι τα επίπεδα μεθυλίωσης αποτελούν δείκτη επιβίωσης στα άτομα με ΗKK. Για την χρήση του ποσοστού μεθυλίωσης στον υποκινητή του γονιδίου hTERT ως προγνωστικό δείκτη και σε άτομα με χρόνια ιογενή ηπατοπάθεια επιβάλλεται επιβάλλεται η μεγαλύτερη διάρκεια παρακολούθησης των ασθενών (follow up) που παρουσίασαν χαμηλά επίπεδα μεθυλίωσης και επομένως σημαντική έκφραση της τελομεράσης.