Διερεύνηση του ρόλου των SR πρωτεϊνικών κινασών στην γονιδιακή έκφραση: μελέτη της βιολογικής σημασίας της μοριακής αλληλεπίδρασης ενός καινούργιου μέλους της οικογένειας, της SRPKla,, με τον πρωτεϊνικό παράγοντα SAFB

Abstract

SRPKla is a new member ofthe SR protein kinase family, which specifically phosphorylates substrates containing regions rich in arginine-serine dipeptides (RS motifs). The SRPKla transcript is the product of alternative splicing of the SRPK1 gene containing an additional exon at its 5' end.In the present thesis the biological significance of the interaction of SRPKla with the nuclear matrix protein SAFB1 that does not contain an RS motif and therefore is not a physical substrate ofthe kinase was studied. In order to investigate the effect of SAFB1 on the activity of SRPKla, in vitro phosphorylation assays of known substrates of the kinase were carried out. In these experiments it was found that the activity of SRPKla and SRPK1 (which interacts with SAFB1 at a lower degree) is inhibited by the presence ofthis factor. Additional in vitro phosphorylation assays showed that the region of SAFB1 rich in RE dipetides, that resemble chemically phosphorylated RS dipeptides, is not responsible for its behavior as an inhibitor, because in the presence of SAFB1 lacking this region the activity of SRPKla is inhibited, while in the presence of SAFB2 which also contains a regionrich in RE at its carboxy-terminal domain, the activity ofthe kinase is not inhibited. In order to investigate the effect of SAFB1 on the subcellular localization of SRPKla, fluorescence and immunofluorescence experiments were carried out following co-expression of the two proteins in HeLa cells. It was observed that although in the absence of SAFB1, SRPKla is localized mainly in the cytoplasm and at a lower extent in the nucleus, in the presence of SAFB1 it becomes exclusivelynuclear. In parallel, the effect of SAFB2 on the localization of SRPKla was examined but the kinase was found to remain mainly cytoplasmic in its presence. The different effect of SAFB1 in regard to SAFB2 on the activity and localization of the kinases seems from the results of the affinity chromatography experiments to relate with the affinity that the factors SAFB1 and SAFB2 exhibit for the two kinases. Finally, in order to discover novel properties of SAFB1 that may play a role inits functional relationship with SRPKla, a search for new molecular partners of SAFB1 had been performed via the two hybrid system. Among the new molecular interactions of SAFB1 that emerged, the protein ERPI, which interacts strongly with SAFB1 but not with SAFB2 (just like SRPKla), was chosen for further study. The ability of structural discrimination of the protein ERH between SAFB1 and SAFB2 was confirmed in vitro by affinity chromatography experiments.

Η SRPKla αποτελεί ένα νέο μέλος της οικογένειας των SR πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες φωσφορυλιώνουν υποστρώματα που περιέχουν περιοχές πλούσιες σε αργινίνη και σερίνη (μοτίβα RS). Το μετάγραφο της SRPKla προέρχεται από εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου της SRPK1 και διαφέρει μόνο κατά ένα επιπλέον εξόνιο στο 5' άκρο του. Στην παρούσα διατριβή μελετάται η βιολογική σημασία της αλληλεπίδρασης της SRPKla με έναν πρωτεϊνικό παράγοντα της πυρηνικής μήτρας, τον SAFB1, ο οποίος δεν περιέχει μοτίβο RS και άρα δεν αποτελεί φυσικό υπόστρωμα της κινάσης. Με σκοπό να μελετηθεί η επίδραση του παράγοντα SAFB1 στη δράση της SRPKla, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες in vitro φωσφορυλίωσης γνωστών υποστρωμάτων της κινάσης. Βρέθηκε ότι η δράση της SRPKla και της SRPK1 (η οποία αλληλεπιδρά σε μικρότερο βαθμό με τον SAFB1) αναστέλλεται παρουσία αυτού του παράγοντα. Επιπρόσθετες δοκιμασίες in vitro φωσφορυλίωσης έδειξαν ότι η πλούσια σε διπεπίδια RE περιοχή του SAFB1 που προσομοιάζει χημικά με φωσφορυλιωμένη αλληλουχία RS, δεν ευθύνεται για την συμπεριφορά του ως αναστολέα καθώς παρουσία του SAFB1 χωρίς αυτή τη περιοχή αναστέλλεται και πάλι η δράση της SRPKla, ενώ παρουσία του SAFB2, ο οποίος επίσης περιέχει στο καρβοξυτελικό του άκρο περιοχή πλούσια σε RE, η δράση της κινάσης δεν αναστέλλεται. Στα πλαίσια της διερεύνησης της επίδρασης του παράγοντα SAFB1 στον κυτταρικό εντοπισμό της SRPKla, πραγματοποιήθηκαν πειράματα φθορισμού- ανοσοφθορισμού μετά από συνέκφραση των δύο πρωτεϊνών σε κύτταρα HeLa. Παρατηρήθηκε ότι ενώ απουσία του SAFB1 η SRPKla εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και λιγότερο στον πυρήνα, παρουσία του SAFB1 ο κυτταρικός εντοπισμός της γίνεται αποκλειστικά πυρηνικός. Παράλληλα διερευνήθηκε και η επίδραση του SAFB2 στον εντοπισμό της SRPKla παρουσία του οποίου βρέθηκε ότι η κινάση παραμένει κυρίως κυτταροπλασματική. Η διαφορετική επίδραση του SAFB1 σε σχέση με τον SAFB2 στη δράση και τον εντοπισμό των κινασών φαίνεται από αποτελέσματα πειραμάτων χρωματογραφίας αγχιστείας να αντικατοπτρίζει τη διαφορετική αγχιστεία που παρουσιάζουν οι παράγοντες SAFB για τις δύο κινάσες. Τέλος, προκειμένου να αποκαλυφθούν νέες ιδιότητες του SAFB1 που πιθανόν παίζουν ρόλο στη λειτουργική του σχέση με την SRPKla είχε γίνει αναζήτηση νέων μοριακών παρτενέρ του SAFB1 μέσω του συστήματος των δύο υβριδίων. Από τις νέες μοριακές αλληλεπιδράσεις του SAFB1 επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη η πρωτεΐνη ERH, η οποία αλληλεπιδρά ισχυρά με τον SAFB1 αλλά όχι με τον SAFB2 (όπως και η SRPKla). Με πειράματα χρωματογραφίας αγχιστείας επιβεβαιώθηκε in vitro η ικανότητα δομικής διάκρισης της ERH μεταξύ των SAFB1 και SAFB2.