Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων συνθετικών αναλόγων της ωκυτοκίνης με ανταγωνιστική δράση: σχέσεις δομής - βιολογικής δραστικότητας

Abstract

In the present study we present the synthesis and pharmacological investigation of twenty seven newly synthesized oxytocin analogues. Basic modification at positions 7, 8 and 9 (introduction of α,α-dialkyl amino acid, α-aminoisobutyric acid [Aib] or the unnatural imino acid D-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid [D-Tic] or tert-butyl-glycine [(But)Gly]) was combined with D-Cys6/Pen6, D-Tyr(Et)2, and D-Nal(1)2, Mpa1/Pen1 modifications and their various combinations.The new analogues (following table) were synthesized by Fmoc solid phase methodology utilizing a 2-chlorotrityl chloride resin as solid support bearing a Rink-Bernatowitz linker to provide the peptidic amide and diisopropylcarbodiimide/1-hydroxy-benzotriazol (DIC/HOBt) as coupling agent. The cyclization was performed in DMSO/H2O (2:8, v/v) for 24-36h Final purification was achieved by preparative HPLC (Pharmacia LKB-2250) on reversed-phase support C-18 with a linear gradient from 25 to 75% acetonitrile (0.1% TFA) for 35 min. The appropriate fractions were pooled and lyophilized. Electron-spray MS were in agreement with the expected results.The analogues were tested for their potency in two pharmacological tests, i.e. uterotonic in vitro test in the absence of magnesium ions on an isolated strip of rat uterus and in the pressοr test on phenoxybenzamine treated male rats. Parallel determination of binding affinity of the analogues to cloned human oxytocin recep-tors on HEK cell membranes using tritiated oxytocin from NEN Life Science, Boston, MA, USA was performed. We obtained a satisfactory number of quite potent and selective (as it concerns the binding with the vasopresor receptor V1a) oxytocin antagonists. Ten of these analogues showed higher antagonistic affinity than Atosiban (pA2=8.29) and they were completely inactive as far as it concerns the rat pressor test. Three of them (MOPACIN I, II and III) are under patent procedure. On the other hand, as it concerns the binding affinity and the biological evaluation, we observed a paradox phenomenon. Despite the high anta-gonistic potencies the affinity to the receptor was lower than oxytocin. This may be attri-buted to the species difference.Furthermore, some of the analogues were tested as far as it concerns their ability to in-crease or decrease the growth of MCF-7 breast cancer cells. The results indicate the ability of some analogues to decrease the growth of the MCF-7 breast cancer cells, but these re-sults need further investigation due to extract safe conclusions.Finally, the results from the presence study may aid in the design of novel and selective antagonists of oxytocin with pharmacological/pharmaceutical use. Furthermore, the evi-dence that some analogues have the ability to decrease the growth of MCF-7 cells, may find future applications in the radioimaging of different neoplasms, as wel as in their therapy, using oxytocin analogues that conserve high oxytocin receptor affinity as either radiotracers or chemiotherapeutic vectors.

Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται η σύνθεση εικοσιεπτά νέων αναλόγων της ωκυτοκίνης (ΟΤ), τα οποία περιέχουν πέραν της Gly(But)8 ή/και Gly(But)9 και Gly(But)3 ή/και Gly(But)7, D-Cys6;ή Pen6, το μη φυσικό αμινοξύ α-αμινοϊσοβουτυρικό οξύ (Aib), το ιμινοξύ 1,2,3,4- τετραϋδροκινολινο-3-καρβοξυλικό οξύ (Tic) στη D- μορφή του στις θέσεις 7 ή/και 9 και τέλος τα παράγωγα D-Tyr(Et) και D-Nal(1) στη θέση 2. Τα νέα αυτά ανάλογα παρουσιάζονται στον πίνακα που ακολουθεί.H σύνθεση των νέων αναλόγων έγινε σύμφωνα με την Fmoc/But μεθοδολογία σύνθεσης επί στερεάς φάσεως σε στερεό υπόστρωμα Rink Bernatowitz 2-χλωροτριτυλο-ρητίνη. H απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας επιτυγχάνεται με επίδραση διαλύματος 20% πιπεριδίνης σε DMF και οι συζεύξεις πραγματοποιήθηκαν με τη μέθοδο του διϊσοπροπυλοκαρβοδιϊμιδίου/1-υδροξυ-βενζοτριαζολίου (DIC/HOBt) για 2 ώρες.Η απομάκρυνση του πεπτιδίου από το στερεό υπόστρωμα επετεύχθη με κατεργασία της ρητίνης με διάλυμα τριφθοροξικού οξέος-διχλωρομεθανίου (80:15,v/v) παρουσία δεσμευτών κατιόντων για 4 ώρες. Η δημιουργία του δισουλφιδικού δεσμού πραγματοποιήθηκε μετά από παραμονή των απροστάτευτων πεπτιδίων σε διάλυμα DMSO/H2O (20:80, v/v) για 36-48h. Η απομόνωση σε καθαρή κατάσταση έγινε με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης ανάστροφης φάσης (RP-HPLC) σε σύστημα διαλυτών CH3CN/H2O μεταβαλλόμενης σύστασης (από 25% CH3CN έως 75% CH3CN για 30 min σε 0,05% CF3COOH/H2O). Τα παρασκευασθέντα πεπτίδια ταυτοποιήθηκαν με ES-MS. Τα πεπτίδια δοκιμάστηκαν όσον αφορά στην ωκυτόκειο δράση in vitro, σε απομονωμένο ιστό μήτρας επίμυος ενώ η δοκιμή επί της πιέσεως πραγματοποιήθηκε σε επίμυες οι οποίοι είχαν επεξεργαστεί με φαινοξυβενζαμίνη. Από τα προκαταρκτικά βιολογικά αποτελέσματα φαίνεται ότι τα συντεθέντα ανάλογα παρουσιάζουν στο σύνολό τους ανταγωνιστικές ιδιότητες, 10 εκ των οποίων παρουσίασαν ιδιαίτερα ισχυρή ανταγωνιστική δράση και εκλεκτικότητα εφ’ όσον στη δοκιμή επί της πιέσεως δεν εμφάνισαν δράση. Τα 10 αυτά ανάλογα εμφανίζουν ανταγωνιστική ισχυρότερη από αυτήν του Atosiban (pA2=8,29±0,05) και είναι εκλεκτικά. Επιπλέον, τρία από τα νέα ανάλογα (MOPACIN I,II και III) βρίσκονται σε διαδικασία κατοχύρωσης.Τα νέα ανάλογα δοκιμάστηκαν και όσον αφορά στη συγγένεια τους με τον ανθρώπινο ωκυτόκειο υποδοχέα, η δοκιμή πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (HEK) τα οποία υπερεκφράζουν τον υποδοχέα. Υπήρξε μια διαφοροποίηση μεταξύ των αποτελεσμάτων από τη βιολογική δράση και την συγγένεια με τον υποδοχέα, αφού ανάλογα με ισχυρή ανταγωνιστική δράση (π.χ. ανάλογο 23 με τιμή pA2 =8,31 και συγγένεια με τον υποδοχέα περισσότερο από 100 φορές χαμηλότερη σε σύγκριση με αυτή της φυσικής ορμόνης) εμφάνισαν χαμηλή συγγένεια με τον υποδοχέα. Η διαφοροποίση αυτή ίσως οφείλεται στις διαφορές μεταξύ των ειδών.Επιπρόσθετα, κάποια από τα ανάλογα αυτά δοκιμάστηκαν όσον αφορά στην επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού (MCF-7). Τα αποτελέσματα αυτών αποτελούν ένδειξη της βιολογικής δράσης των συνθετικών πεπτιδίων. Όμως χρειάζεται περισσότερη διερεύνηση ο ρόλος τους για την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων.Εν κατακλείδι, τα συμπεράσματα στα οποία καταλήγουμε, όσον αφορά στην παρούσα διατριβή προσφέρουν νέα δεδομένα όσον αφορά στη σύνθεση και τον σχεδιασμό νέων αναλόγων της ωκυτοκίνης τα οποία πιθανότατα θα αποτελέσουν και καλούς ανταγωνιστές με ενδεχόμενη θεραπευτική/φαρμακευτική εφαρμογή. Επιπλέον, το εύρημα ότι η ωκυτοκίνη καθώς και τα ανάλογα αυτής μπορεί να εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων μπορεί να βρει εφαρμογή στην ραδιοαπεικόνιση διαφόρων νεοπλασμάτων, καθώς και στη θεραπεία αυτών. Επίσης ανάλογα της ωκυτοκίνης τα οποία παρουσιάζουν υψηλή συγγένεια με τον υποδοχέα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ραδιοϊχνηθέτες ή ως χημειοθεραπευτικοί φορείς.