Ο ρόλος των ενεργών μορφών οξυγόνου στην αναγεννητική ικανότητα των πρωτοπλαστών

Abstract

Our previous results have shown that oxidative stress may reduce the regeneration potential of protoplasts but also, only protoplasts that are able to supply extracellularly H2O2 can actually divide (Siminis et al., 1993, 1994, de Marco and Roubelakis-Angelakis, 1996a, 1996b, 1999). In this work we have attempted to break down the oxidative burst response into individual active oxygen species (AOS), O2 -. and H2O2, and generating systems during isolation of regenerating tobacco (Nicotiana tabacum L.) and nonregenerating grapevine (Vitis vinifera L.) mesophyll protoplasts. Wounding of leaf tissue or use of purified cellulase did not elicit AOS production. Use of non-purified cellulaseOnozuka during maceration induced a burst of O2 -. and H2O2 accumulation in tobacco leaf, while in grapevine significantly lower levels of both AOS were accumulated. When protoplasts isolated with purified cellulase were treated with non-purified cellulase, AOS were also generated with significant quantitative differences between the two species. In tobacco protoplasts and plasma membrane vesicles, two different AOS synthase activities were revealed; one that showed specificity to NADPH and sensitivity to DPI and was responsible for O2-. production, and a second NAD(P)H activity, sensitive to KCN and NaN3, contributing to the production of both AOS. The first activity probably refers to a mammalian-like NADPH oxidase and the second to a NAD(P)H oxidase-peroxidase. In grapevine only one AOS generating activity was detected and was responsible for the generation of both AOS. Τobacco protoplasts resulted from non-purified cellulase showed greater O2.- and H2O2, mostly intracellularly, and lower viability and plating efficiency (nonregenerating, NR-), compared to protoplasts isolated with purified cellulase (regenerating, R-). Grapevine protoplasts failed to divide at all treatments (recalcitrant, nonregenerating, NR-). In NR- grapevine protoplasts, AOS accumulation was significantly lower. During a culture period of 8 days, R- and NR- tobacco protoplasts and grapevine protoplasts exhibited lower AOS levels both intra- and extracellularly, compared to freshly isolated protoplasts; higher O2.- and H2O2 the day 8 in NR-ones, was the main difference between Rand NR- tobacco protoplasts. In R-tobacco protoplasts, ASA and GSH predominated, whereas in the NR-ones and grapevine protoplasts, DHA and GSSG did. Furthermore, SOD, APO, MDAR, DHAR, GR and GS-POX activities were significantly greater in R-tobacco than in NR-tobacco and grapevine protoplasts. The increase in SOD and APO was due to the expression of cytoplasmic isoenzymes. Cultured protoplasts from transgenic tobacco plants expressing antisense RNA for cytoplasmic APO, showed the same level of viability and plating efficiency and of enzymic and nonenzymic antioxidants, as the control protoplasts. Protoplast death was induced when APO activity was inhibited up to 45%, with the addition of pCMB in protoplastculture medium. Significant higher endogenous polyamine levels and predominated conjugated forms were found in R-tobacco protoplasts compared to NR- tobacco and especially, grapevine protoplasts. These results suggest that a collapse of defense mechanism against oxidative stress occurred in NRtobacco and grapevine protoplasts, suggesting that suppressed expression oftotipotency in protoplasts is correlated with reduced antioxidant machinery.

Προηγούμενα αποτελέσματα του Εργαστηρίου έδειξαν ότι η οξειδωτική καταπόνηση εμπλέκεται στην μείωση του αναγεννητικού δυναμικού των πρωτοπλαστών, όμως μόνο οι πρωτοπλάστες που είναι ικανοί να παράγουν εξωκκυταρικό H2O2 μπορούν να διαιρεθούν (Siminis et al., 1993, 1994, de Marco and Roubelakis-Angelakis, 1996a, 1996b, 1999). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η παραγωγή των ενεργών μορφών οξυγόνου (ΕΜΟ), του Ο2-. και του H2O2, κατά την απομόνωση αναγεννώμενων πρωτοπλαστών καπνού (Nicotiana tabacum L.) και μη αναγεννώμενων πρωτοπλαστών καπνού και αμπέλου (Vitis vinifera L.), καθώς και τα συστήματα παραγωγής τους. Η χρησιμοποίηση κυτταρινάσης Onozuka προκάλεσε ραγδαία συσσώρευση του O2-. και του H2O2 στο μέσο επώασης των φύλλων καπνού, ενώ η αντίστοιχη παραγωγή ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην άμπελο. Ο τραυματισμός των φύλλων ή η χρησιμοποίηση καθαρής κυτταρινάσης Worthington δεν οδήγησε σε αύξηση των ΕΜΟ. Η προσθήκη κυτταρινάσης Onozuka σε πρωτοπλάστες, που απομονώθηκαν με κυτταρινάση Worthington, προκάλεσε οξειδωτική έκρηξη στο μέσο καλλιέργειας, όπου η συσσώρευση των ΕΜΟ χαρακτηρίστηκε από σημαντικές ποιοτικές και ποσοτικές διαφορές μεταξύ των δύο φυτών. Στους πρωτοπλάστες και σε απομονωμένες κυτταρικές μεμβράνες καπνού, ανιχνεύτηκαν δυο διαφορετικές ενεργότητες σύνθεσης ΕΜΟ: μία, που παρουσίασε εξειδίκευση στο NADPH και ευαισθησία στο DPI, ήταν υπεύθυνη για την παραγωγή του Ο2-. και αντιστοιχεί μάλλον σε ένα ένζυμο παρόμοιο με την NADPH οξειδάση των θηλαστικών, και μία δεύτερη NAD(P)H οξειδάση-υπεροξειδάση, ευαίσθητη στο KCN και το NaN3, που συμβάλλει στην παραγωγή και των δύο ΕΜΟ. Στην άμπελο, μόνο το δεύτερο ενζυμικό σύστημα ανιχνεύτηκε. Οι πρωτοπλάστες που απομονώθηκαν με κυτταρινάση Onozuka, παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα ΕΜΟ, κυρίως σε ενδοκυτταρικό επίπεδο, και χαμηλότερη βιωσιμότητα και διαιρετική ικανότητα, σε σχέση με εκείνους που προέκυψαν από κυτταρινάση Worthington. Η συγκέντρωση των ΕΜΟ μειώθηκε προοδευτικά κατά την καλλιέργεια, όμως στους μη αναγεννώμενους πρωτοπλάστες, οι ενδοκυτταρικές ΕΜΟ αυξήθηκαν την 8η ημέρα καλλιέργειας. Οι μη αναγεννώμενοι πρωτοπλάστες καπνού και εντονότερα οι πρωτοπλάστες αμπέλου, χαρακτηρίστηκαν από χαμηλό οξειδοαναγωγικό δυναμικό του ασκορβικού και της γλουταθειόνης, με τις οξειδωμένες μορφές να κυριαρχούν κατά την καλλιέργεια. Η ενεργότητα των ενζύμων που αποσβένουν τις ΕΜΟ, της SOD, της APO της MDΗAR, της DHAR, της GR και της GS-PER ήταν σημαντικά υψηλότερη στους αναγεννώμενους πρωτοπλάστες καπνού σε σχέση με τους μη αναγεννώμενους και με τους πρωτοπλάστες αμπέλου, όπου δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή κατά την καλλιέργεια. Η αύξηση στην ενεργότητα της SOD και της APO στους αναγεννώμενους πρωτοπλάστες καπνού οφειλόταν στην επαγωγή του κυτοπλασμικού ισοενζύμου. Πρωτοπλάστες από γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού με αντιπληροφοριακό RNA για την APO, δεν παρουσίασαν διαφορές με τον μάρτυρα, όσον αφορά τη βιωσιμότητα και την αντιοξειδωτική μηχανή. Όμως, η αναστολή της ενεργότητας της ΑΡΟ, με την χρησιμοποίηση του παρεμποδιστή pCMB, πάνω από 45% οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο των πρωτοπλαστών. Οι αναγεννώμενοι πρωτοπλάστες καπνού παρουσίασαν σταδιακή αύξηση των πολυαμινών κατά την καλλιέργεια, και τις υψηλότερες συγκεντρώσεις, με επικράτηση των διαλυτών συζευγμένων πολυαμινών, ενώ οι μη αναγεννώμενοι πρωτοπλάστες καπνού και αμπέλου, με αυτή τη σειρά, παρουσίασαν χαμηλότερα επίπεδα. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η καταστολή της έκφρασης του ολοδυναμικού, που παρατηρείται στους μη αναγεννώμενους πρωτοπλάστες, μπορεί να σχετιστεί με την κατάρρευση του αμυντικού μηχανισμού κατά της οξειδωτικής καταπόνησης.