Transcriptional and posttranscriptional regulation of deoxycytidine kinase

Abstract

Η κινάση της δεοξυτιδίνης καταλύει τη φωσφορυλίωση της 2-δεοξυκυτιδίνης στην μονοφωσφορική της μορφή. Έχει βρεθεί να φωσφορυλιώνει μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων όπως δεοξυπουρίνες και δεοξυπυριμιδίνες. Η κυνάση αυτή είναι επίσης υπεύθυνη για την αρχική ενεργοποίηση ενός μεγάλου αριθμού κλινικά σημαντικών αναλόγων των νουκλεοσιδίων που χρησιμοποιούνται ως αντικαρκινικά και αντιϊικά φάρμακα. Η έλλειψη έκφρασης ή ενεργότητας της κινάσης dCK σε κύτταρα οδηγεί σε ανθεκτικότητα των κυττάρων αυτών στα παραπάνω φάρμακα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το ένζυμο αυτό παίζει ρόλο "κλειδί" στον μεταβολισμό τους που τουσ προσδίδει και την φαρμακολογική τους δραστικότητα. Για τους λόγους αυτούς η αποσαφήνιση των πιθανών ρυθμιστικών μηχανισμών που παίζουν ρόλο στην ενεργοποίηση της dCK είναι ιδιαίτερα σημαντική. Στην εργασία αυτή μελετάμε τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την έκφραση της dCK σε μεταγραφικό και μετα-μεταγραφικό επίπεδο. 1. Το πρότυπο ρύθμισης της έκφρασης της dCK του ποντικού βρέθηκε ότι είναι αρκετά πολύπλοκο. Μεταλλαγές-ελλείψεις της 5' περιοχής του υποκινητή και in votro footprinting πειράματα έδειξαν ότι οι περιοχές του υποκινητή πλησιέστερες στο σημείο εκκίνησης της μεταγραφής συμβάλλουν στην ιστοειδική έκφραση του γονιδίου. Αναπάντεχα, πειράματα παροδικής διαμόλυνσης έδειξαν ότι η 5' μη μεταφραζόμενη περιοχή του dCK mRNA είχε την μέγιστη ενεργότητα γεγονός που υποδηλώνει ότι πιθανά παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου. Παρ' όλα αυτά, χρειάζονται επιπλέον πειράματα για να αποδειχθεί αν τα αποτελέσματα αυτά συμβαδίζουν με την in vivo κατάσταση. 2. Παρ'όλο που βιοχημικές μελέτες έδειξαν ότι η dCK κινάση δεν έχει ισομορφές όπως η κινάση της θυμιδίνης η εργασία αυτή δείχνει την ύπαρξη ενός δεύτερου γονιδίου με μεγάλη ομολογία με το mdck. Τα χαμηλά επίπεδα έκφρασης και η πιθανή ιστοειδική έκφρασή του αποτέλεσαν εμπόδια στην κλωνοποίηση του cDNA του γονιδίου αυτού. Ανάλυση της αλληλουχίας του έδειξε ότι αυτό το γονίδιο δεν έχει ιντρόνια και μπορεί να δημιουργήθηκε από ένα 'πρόγονο' που περιείχε ιντρόνια. Η ένθεση ενός τέτοιου τμήματος DNA που προέρχεται από το MRNA του προγόνου του, στο οποίο έχει προηγηθεί μάτισμα, στο γένωμα του ποντικού, γίνεται συνήθως με τη μεσολάβηση επαναλαμβανόμενων νουκλεοτιδίων, συνήθως στο 5' άκρο του γονιδίου. 3. Η μελέτη μας πάνω σε μία κυτταρική σειρά ανθεκτική στο φάρμακο dFdCyd έδειξε ότι το φαινόμενο της ανθεκτικότητας κάποιων κυττάρων σε φάρμακα που συνήθως συνοδεύεται από έλλειψη της ενεργότητας της dCK κινάσης οφείλεται σε κάποια ανακατάταξη της περιοχής του γενώματος που εντοπίζεται το dck αλλά σε πιθανούς μετα-μεταγραφικούς και μετα-μεταφραστικούς μηχανισμούς. 4. Επίσης αναλύσαμε τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της dCK κάνοντας πειράματα ανοσοεντοπισμού σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα βιοχημικά διαμερισματοποιημένων κυττάρων, καθώς και in situ ανοσοιστοχημεία χρησιμοποιώντας υψηλής ειδικότητας dCK αντίσωμα. H dCK πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα αλλά ότνα την υπερεκφράσουμε σε κύτταρα εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα. Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν την ύπαρξη ενός μηχανισμού συγκράτησης της dCK στο κυτταρόπλασμα στον οποίο πιθανά ενέχεται μία άλλη πρωτεΐνη που δημιουργεί σύμπλοκο με την dCK. 5. Μία επιπλέον εργασία συμπεριλήφθηκε σε αυτή τη διατριβή που εμπεριέχει την προσπάθεια αναβάθμισης της ειδικότητας της κινάσης δεοξυνουκλεοσιδίων της δροσόφιλας melanogaster (Dm-dNK) σε διάφορα υποστρώματα. Χρησιμοποιώντας την τεχνική PCR και με τυχαία μεταλλαξογένεση δείξαμε ότι αντικαταστάσεις αμινοξέων στην Dm-dNK πρωτεΐνη μπορούν να αλλάξουν την ενζυματική της ενεργότητα απέναντι σε συγκεκριμένα υποστρώματα. Οι μεταλλαγμένες μορφές της κινάσης με τον επιθυμητό φαινότυπο θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν μακροπρόθεσμα σε εφαρμογές της γονιδιακής θεραπείας ως γονίδια 'αυτοκαταστροφής' ενός καρκινικού κυττάρου (suicide gene).