Περίληψη
Η παρούσα διατριβή εστιάσθηκε στην ανάλυση της δομής και της λειτουργίας της αποΑ-Ι. Σκοπός της διατριβής ήταν να κατανοηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο συγκεκριμένες λειτουργικές περιοχές και επιμέρους αμινοξέα της αποΑ-Ι συμβάλλουν στις φυσιολογικές της λειτουργίες όπως στην σύνδεση με φωσφολιπίδια, την ενεργοποίηση του ενζύμου Ακυλοτρανσφεράση της Λεκιθίνης-Χοληστερόλης (LCAT), την σύνδεση με τον υποδοχέα ΄καθαριστή' τάξης Β, τύπου Ι (SR-BI). Πραγματοποιήθηκε μεταλλαξιγένεση στο ανθρώπινο γονίδιο της αποΑ-Ι, και μετά από επιμόλυνση και επιλογή δημιουργήθηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τις μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι. Oι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες απομονώθηκαν από το μέσο καλλιέργειας και χρησιμοποιήθηκαν σε λειτουργικές και δομικές μελέτες. Τα πειράματα σύνδεσης των μεταλλαγμένων μορφών με το φωσφολιπίδιο Διμυριστοϋλ-φωσφατιδυλο-χολίνη (DMPC) έδειξαν ότι η καρβοξυτελική περιοχή της αποΑ-Ι είναι σημαντική για την αλληλεπίδραση της αποΑ-Ι με λιποσώματα φωσφολιπιδίων. Η απ ...
Η παρούσα διατριβή εστιάσθηκε στην ανάλυση της δομής και της λειτουργίας της αποΑ-Ι. Σκοπός της διατριβής ήταν να κατανοηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο συγκεκριμένες λειτουργικές περιοχές και επιμέρους αμινοξέα της αποΑ-Ι συμβάλλουν στις φυσιολογικές της λειτουργίες όπως στην σύνδεση με φωσφολιπίδια, την ενεργοποίηση του ενζύμου Ακυλοτρανσφεράση της Λεκιθίνης-Χοληστερόλης (LCAT), την σύνδεση με τον υποδοχέα ΄καθαριστή' τάξης Β, τύπου Ι (SR-BI). Πραγματοποιήθηκε μεταλλαξιγένεση στο ανθρώπινο γονίδιο της αποΑ-Ι, και μετά από επιμόλυνση και επιλογή δημιουργήθηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τις μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι. Oι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες απομονώθηκαν από το μέσο καλλιέργειας και χρησιμοποιήθηκαν σε λειτουργικές και δομικές μελέτες. Τα πειράματα σύνδεσης των μεταλλαγμένων μορφών με το φωσφολιπίδιο Διμυριστοϋλ-φωσφατιδυλο-χολίνη (DMPC) έδειξαν ότι η καρβοξυτελική περιοχή της αποΑ-Ι είναι σημαντική για την αλληλεπίδραση της αποΑ-Ι με λιποσώματα φωσφολιπιδίων. Η απαλοιφή τμημάτων της καρβοξυτελικής περιοχής της πρωτεΐνης (αμινοξέα 167-243) (έλικες 7-10) αναστέλλει την αλληλεπίδραση των μεταλλαγμένων μορφών με λιποσώματα φωσφολιπιδίων. Αντίθετα η σημειακή αντικάσταση των αμινοξέων γλυκινών στις θέσεις 185 και 186 από προλίνες δεν επηρεάζει την ταχύτητα διαλυτοποίησης λιποσωμάτων φωσφολιπιδίων. Η μελέτη της ικανότητας ενεργοποίησης του ενζύμου LCAT από δισκοειδή σωματίδια ανασυγκροτημένης HDL, που περιέχουν τις μεταλλαγμένες μορφές έδειξε ότι σε σύγκριση με τον φυσικό τύπο της αποΑ-Ι οι μεταλλαγμένες μορφές (Δ165-175) και (G185>P, G186>P) μειώνουν την ενεργοποίηση του νεζύμου LCAT σε ποσοστό 60%. Οι μεταλλαγμένες μορφές (Δ187-197), (Δ185-243), (Δ198-243), (Δ220-243) και (Δ232-243) μειώνουν ακόμη περισσότερο την ενεργοποίηση σε ποσοστά 37-48 %. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η έλικα 7 καθώς και οι καρβοξυτελικές έλικες 8-10 είναι σημαντικές για την ενεργοποίηση του ενζύμου LCAT. Τα πειράματα διασύνδεσης έδειξαν ότι η καρβοξυτελική περιοχή της αποΑ-Ι συμμετέχει στον σχηματισμό ολιγομερών της πρωτεΐνης σε διάλυμα. Η απαλοιφή τμημάτων της καρβοξυτελικής περιοχής της αποΑ-Ι επιτρέπει τον σχηματισμό μικρής ποσότητας διμερών, αλλά εμποδίζει τον σχηματισμό τριμερών και τετραμερών, σε υψηλές συγκεντρώσεις σε διάλυμα.Τα πειράματα ραδιοσήμανσης και απομάκρυνσης του ραδιενεργού αμινοξέος έδειξαν ότι υπάρχει επιβράδυνση στην κινητική της έκκρισης των μεταλλαγμένων μορφών (Δ165-243) και (Δ175-243). Ο χρόνος ημίσσειας ζωής της ενδοκυττάριας μορφής της αποΑ-Ι για τις μεταλλαγμένες μορφές είναι περίπου διπλάσιος αυτού της αποΑ-Ι του φυσικού τύπου. Οι απαλοιφές των καρβοξυτερματικών αμινοξέων 165-243 ή 175-243 πιθανόν αποσταθεροποιούν την αποΑ-Ι μέσα στα κύτταρα και επιβραδύνουν την έκκρισή της. Στα πλαίσια της μελέτης της σύνδεσης της αποΑ-Ι στον υποδοχέα της HDL, SR-BI, αναπτύχθηκε μια νέα τεχνική την οποία ονομάσαμε τεχνική ανοσο-υποδοχέα. Η τεχνική αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως απλή και εναλλακτική μέθοδος για την εκτίμηση της πρόσδεσης συνδετών που περιέχουν αποΑ-Ι στον υποδοχέα SR-BI χωρίς να απαιτείται η ραδιοσήμανσή τους. Με την τεχνική αυτή η πρόσδεση του μη-ραδιοσημασμένου συνδέτη σε κύτταρα εκτιμάται με ποσοτική ανοσο-αποτύπωση. Η ανάλυση διαφόρων συνδετών έδειξε ότι δισκοειδή σωματίδια ανασυγκροτημένης HDL που περιέχουν αποΑ-Ι συνδέονται με υψηλή συγγένεια στον υποδοχέα SR-BI, ενώ η ελεύθερη αποΑ-Ι και η μορφή της πρε-β-1 HDL δεν εμφανίζουν SR-BI-εξαρτώμενη σύνδεση. Επιπλέον η αύξηση της πυκνότητας των σωματιδίων της σφαιρικής HDL μειώνει την συγγένεια σύνδεσης τους με τον υποδοχέα SR-BI. Η μελέτη της σύνδεσης των μεταλλαγμένων μορφών της αποΑ-Ι υπό την μορφή δισκοειδών σωματιδίων έδειξε ότι η ισχυρή σύνδεση των σωματιδίων στον υποδοχέα SR-BI μπορεί να επιτευχθεί με την κεντρική περιοχή του μορίου της αποΑ-Ι (αμινοξέα 60-184), σε συνδυασμό με είτε την καρβοξυτελική είτε την αμινοτελική περιοχή της πρωτεΐνης. Συνεπώς η αμινοτελική (1-59) και η καρβοξυτελική (185-243) περιοχή του μορίου της αποΑ-Ι επηρεάζουν με ανεξάρτητο μηχανισμό την σύνδεση στον υποδοχέα SR-BI, είτε άμεσα, είτε μέσω αλλαγών στην διαμόρφωση της κεντρικής περιοχής (αμινοξέα 60-184). Συμπερασματικά οι μελέτες επιβεβαιώνουν τον σημαντικό ρόλο της αποΑ-Ι στην σύνδεση της HDL στον υποδοχέα SR-BI. Οι μεταλλαγμένες μορφές της αποΑ-Ι θα χρησιμοποιηθούν στο μέλλον σε μελέτες που αφορούν την επιλεκτική μεταφορά εστέρων χοληστερόλης, μέσω του υποδοχέα SR-BI, την έξοδο χοληστερόλης από κύτταρα, την σύνδεση σε άλλους κυτταρικούς υποδοχείς, καθώς και σε in vivo μελέτες με μεταφορά μέσω αδενοϊών σε ποντίκια.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Apolipoprotein A-I is the major protein constituent of the high density lipoprotein (HDL) particles and plays a crucial role in lipid transport and metabolism. The subject of this study was the structural and functional analysis of human apoA-I. The main focus was to understand how specific domains and residues of apoA-I contribute to its physiological functions, that is its ability to bind to phospholipids and form high density lipoprotein (ΗDL) particles, to activate lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) and to bind to scavenger receptor, class B, type I (SR-BI). We mutated the human apoA-I gene and generated by transfection and selection stable cells lines expressing variantforms of apoA-I. The mutant proteins were purified from the culture media and were used in a variety of functional and structural assays. Dimyristoyl phosphatidyl choline (DMPC) binding assays showed that the carboxy-terminal region of apoA-I is critical for the interaction of apoA-I withmultilamellar phos ...
Apolipoprotein A-I is the major protein constituent of the high density lipoprotein (HDL) particles and plays a crucial role in lipid transport and metabolism. The subject of this study was the structural and functional analysis of human apoA-I. The main focus was to understand how specific domains and residues of apoA-I contribute to its physiological functions, that is its ability to bind to phospholipids and form high density lipoprotein (ΗDL) particles, to activate lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) and to bind to scavenger receptor, class B, type I (SR-BI). We mutated the human apoA-I gene and generated by transfection and selection stable cells lines expressing variantforms of apoA-I. The mutant proteins were purified from the culture media and were used in a variety of functional and structural assays. Dimyristoyl phosphatidyl choline (DMPC) binding assays showed that the carboxy-terminal region of apoA-I is critical for the interaction of apoA-I withmultilamellar phospholipid vesicles. The deletion of regions in the carboxy-terminal domain (residues 167-243) (helices 7-10) inhibits the mutant proteins from solubilizing DMPC vesicles. In contrast the substitution of glycines at positions 185 and 186 with prolines did not affect the ability of the mutant protein to interact and solubilize phospholipid vesicles. LCAT analysis, using reconstituted HDL particles containing the mutant apoA-I forms, showed that the variants (Δ165-175) and (G185→P, G186→P) reduced LCAT activation (60% compared to the wild type apoA-I). Mutants (Δ187-197), (Δ185-243), (Δ198-243), (Δ220-243) and (Δ232-243) reduced even more the activation to 37-48 % of the wild type apoA-I. These findings indicate that helix 7 and the carboxy-terminal helices 8-10 are important for LCAT activation. Cross-linking experiments showed that the carboxy-terminal domain of apoA-I participates in the self association of the protein in solution. The deletion of carboxyterminal domains of the protein results in formation of lower quantities of dimers, and inhibits the formation of higher order oligomers (aggregates) in solution. Pulse chase experiments showed a delay in the kinetics of secretion of the mutant forms (Δ165-243) and (Δ175-243), as demonstrated by the double increase in the half time of the intracellular forms of the mutant proteins compared to that of the wild type apoA-I. The deletion of the carboxy terminal amino acids 165-243 or 175-243 probably destabilizes the protein inside the cell and delays its secretion. In the context of studying the binding of apoA-I to the HDL receptor SR-BI, a newtechnique, called immunoreceptor assay, was developed and was used as a simple and powerful alternative to evaluate receptor-binding parameters of a variety of apoA-I-containing ligands, without the need for iodination. In this assay the unlabeled receptor-associated ligand is detected by quantitative immunoblotting. The analysis of different ligands showed that discoidal reconstituted HDL particles containing apoA-I bind with high affinity to SR-BI, while the lipid-free apoA-I and the pre-β-1 HDL do not exhibit SR-BI-dependent binding. Moreover the increase in the density of spherical HDL resulted in decrease in the binding affinity of HDL to SR-BI. Studies of the binding of reconstituted HDL particles containing the variant apoA-I froms showed that optimal binding of discoidal particles to SR-BI can be achieved by the central domain of apoA-I (residues 60-184) combined with either the amino or carboxy terminal domain. These findings demonstrate the important role of apoA-I in HDL binding to SR-BI and indicate that the amino (1-59) and carboxy (185-243) termini of apoA-I independently influence binding to SR-BI, either directly or through changes in the conformation of the core of apoA-I (residues 60-184). In addition to their use in the present study, the variant apoA-I forms generated will be valuable in the future for studies of selective uptake of cholesterol, mediated by SR-BI, for promoting cholesterol efflux from cells, for binding to other cell surface receptors, and for in vivo studies in transgenic animals.
περισσότερα