Δομική μελέτη του φωτοσυστήματος ΙΙ των ανωτέρων φυτών και φασματοσκοπική μελέτη της λύασης του υδροϋπεροξειδίου των λιπαρών οξέων

Abstract

Photosystem II is a membrane multiprotein complex, which catalyzes water splitting, via a unique mechanism. The significant functional properties of this complex are attributed to its unique structural characteristics. Indirect biochemical studies have yielded information on the location of the PSII proteins. Recently, electron microscopy studies have led to models concerning the relative assembly and subunit topology in PSII. However, the only available information on the PSIIstructure on a molecular level derive from purple photosynthetic bacteria, whose structure has been determined by X-ray crystallography. To date, a three-dimensional model, which would reveal the unique functional properties of PSII, is absent. In the present work the aim has been the structural study of PSII on a molecular level, as well as the level of PSII assembly. The study of the molecularstructure of PSII was based on the production of three dimensional crystals and the analysis of the structure with X-ray crystallography. The analysis of the tertiary structure of PSII was based on electron microscopy studies of the reaction center. Concerning the crystallization of PSII, a new purification protocol was established, which enabled quantitative isolation of CP 47 and the reaction center complex, in a stable state. This protocol is based on the selective extraction of membrane proteins, using the appropriate combination of detergents and the enrichment of the subcomplexes with ultracentrifugation, using a linear sucrose gradient. The crystallization of a PSII membrane protein was accomplished for the first time. In order to improve the CP 47 crystals a thorough screening of the parameters, which influence membrane protein crystallization, was carried out. The low resolution of the crystals was attributed to a degradation of the CP 47 protein. This degradation takes place after the protein’s dissociation from the rest of the complex and continues in the dark. This sensitivity of the protein could be the consequence of structural changes, induced by its dissociation from the core complex. The structural study of the PSII reaction center complex yielded information on the oligomerization state and the location of the membrane proteins in the PSIIcore. The reaction center complex was isolated in a monomeric form and its molecular weight was estimated by a combination of two independent techniques. Analysis of the images, which were obtained by electron microscopy, led to a protein density map of the D1 and D2 subunits. A comparison of the reaction center map to the map of the whole PSII-core complex revealed the relative positions of the major membrane proteins. These results supported a central location for the D1/D2 heterodimer and a peripheral location for CP 47 and CP 43, giving the complex apseudo twofold symmetry. In addition, in the present thesis a study on HPO lyase was carried out. This enzyme is widely spread in plants and its products are involved in plant defense. HPO lyase belongs to a new category of enzymes (CYP 74), which are considered to be a subclass of the cytochrome P450 family. CYP 74 enzymes have unique functional features, since they do not need a reductant and oxygen for their function and exhibit an extremely high turnover rate, in contrast to P450. In the present study HPO lyase was purified from E. coli, which contained the enzyme’s recombinant DNA from green bell pepper. E. coli expression of HPO lyase yielded sufficient amounts of enzyme, which enabled its biochemical and spectroscopical characterization. This work has focused on the structural study of the heme environment of the metal center using UV-Vis spectroscopy and EPR. The spectroscopic study of the enzyme was based on the interaction of exogenous ligands with the heme iron and the comparison of the resulted spectroscopical characteristics to the ones of heme proteins with a known structure. These studies revealed that theheme iron is five-coordinated and that it exists in a high spin state. For the first time, spectroscopic data were obtained which supported that the proximal site is occupied by cystein and that HPO lyase is indeed a cytochrome P450.

Το Φωτοσύστημα ΙΙ είναι ένα μεμβρανικό πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο, το οποίο καταλύει την διάσπαση του νερού, μέσω ενός μοναδικού μηχανισμού. Οι σημαντικές λειτουργικές ιδιότητες του συμπλόκου αυτού αποδίδονται στα μοναδικά δομικά χαρακτηριστικά του. Η δομική μελέτη του PS II ξεκινά από το επίπεδο της τοπολογίας των πρωτεϊνών στο σύμπλοκο και καταλήγει στο επίπεδο της μοριακής δομής. Από έμμεσες βιοχημικές μελέτες έχουν προκύψει μοντέλα για τη σχετική θέση και οργάνωση των υπομονάδων του PS II. Τα τελευταία χρόνια μελέτες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έχουν δώσει μια εικόνα για την τοπολογία του συμπλόκου στο χώρο. Οι μόνες πληροφορίες για την δομή του PS II σε μοριακό επίπεδο προέρχονται από τα φωτοσυνθετικά μωβ βακτήρια η δομή των οποίων έχει προσδιοριστεί με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ. Μέχρι σήμερα απουσιάζει το τρισδιάστατο μοντέλο που θα απεκάλυπτε τα μοναδικά δομικά χαρακτηριστικά του PS II σε ατομικό επίπεδο. Στη παρούσα εργασία στόχος ήταν η δομική μελέτη του PS II σε μοριακό επίπεδο και στο επίπεδο της οργάνωσης των πρωτεϊνών στο σύμπλοκο. H μελέτη της μοριακής δομής του PS II στηρίχθηκε στην ανάπτυξη τρισδιάστατων κρυστάλλων και ανάλυση της δομής με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ. Η ανάλυση της τεταρτοταγούς δομής του PS II βασίστηκε στη μελέτη του συμπλόκου του ενεργού κέντρου με ηλεκτρονική μικροσκοπία. Στα πλαίσια της κρυστάλλωσης του PS II αναπτύχθηκε ένα νέο πρωτόκολλο απομόνωσης, το οποίο εξασφαλίζει την ποσοτική απομόνωση της CP 47 και του συμπλόκου του ενεργού κέντρου σε σταθερή κατάσταση. Το πρωτόκολλο βασίζεται στην επιλεκτική αποδέσμευση των μεμβρανικών πρωτεϊνών με κατάλληλο συνδυασμό απορρυπαντικών και εμπλουτισμό των υποσυμπλόκων με υπερφυγοκέντρηση σε γραμμική διαβάθμιση σουκρόζης. Για πρώτη φορά επιτεύχθηκε η κρυστάλλωση μιας μεμβρανικής πρωτεΐνης του PS II. Για την βελτίωση των κρυστάλλων της CP 47 πραγματοποιήθηκε συστηματική μελέτη των παραμέτρων που επηρεάζουν την κρυστάλλωση των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Η χαμηλή ικανότητα περίθλασης των κρυστάλλων αποδόθηκε στη διάσπαση της CP 47. H διάσπαση της CP 47 ξεκινά αμέσως μετά την αποδέσμευση της από το υπόλοιπο σύμπλοκο και συνεχίζεται στο σκοτάδι. Η ευαισθησία της CP 47 αποδίδεται σε αλλαγή της δομής που οφείλεται στην αποδέσμευση της πρωτεΐνης από το πυρήνα. Από τη δομική μελέτη του συμπλόκου του ενεργού κέντρου του PS II προέκυψαν πληροφορίες για την κατάσταση ολιγομερισμού του και την θέση των μεμβρανικών πρωτεϊνών στον πυρήνα του PS II. To σύμπλοκο του ενεργού κέντρου απομονώθηκε σε μονομερή μορφή και το μοριακό του βάρος προσδιορίστηκε με συνδυασμό δύο ανεξάρτητων τεχνικών. Από την ανάλυση των εικόνων που ελήφθησαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο προέκυψε ο χάρτης κατανομής της πρωτεϊνικής πυκνότητας των υπομονάδων D1 και D2. Από την σύγκριση του χάρτη του συμπλόκου του ενεργού κέντρου με το χάρτη ολόκληρου του πυρήνα αποκαλύφθηκε η σχετική θέση των κυριοτέρων μεμβρανικών πρωτεϊνών. Οι πρωτεΐνες D1 και D2 εντοπίζονται στο κέντρο, ενώ οι CP 47 και CP 43 στην περιφέρεια του συμπλόκου, προσδίδοντας στο πυρήνα του PS II ψευδοσυμμετρία δευτέρας τάξης. Επίσης στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε η μελέτη της λυάσης του υδροϋπεροξειδίου των λιπαρών οξέων (HPO lyase). Το ένζυμο αυτό είναι ευρύτατα διαδεδομένο στο φυτικό βασίλειο και τα προϊόντα της δράσης του εμπλέκονται στον αμυντικό μηχανισμό των φυτών. Η ΗPO lyase ανήκει σε μία νέα κατηγορία ενζύμων (CYP 74), τα οποία προτείνεται ότι ανήκουν στην οικογένεια των κυτοχρωμάτων P450. Τα ένζυμα της κατηγορίας CYP74 εμφανίζουν μοναδικά λειτουργικά χαρακτηριστικά, αφού δεν χρειάζονται αναγωγικό και οξυγόνο για την δράση τους και επιδεικνύουν υψηλούς ρυθμούς ανακύκλησης σε αντίθεση με τα P450. Στην παρούσα εργασία η HPO lyase απομονώθηκε από βακτήρια Ε. coli, τα οποία περιέχουν το ανασυνδιασμένο DNA του ενζύμου από πιπεριά. Από τα βακτήρια η ΗPO lyase εκφράστηκε σε ικανοποιητική ποσότητα, που επέτρεψε τον βιοχημικό και φασματοσκοπικό χαρακτηρισμό του ενζύμου. Η εργασία επικεντρώθηκε στη δομική μελέτη του περιβάλλοντος της αίμης στο ενεργό κέντρο του ενζύμου με φασματοσκοπία απορρόφησης ορατού-υπεριώδους (UV-Vis) και φασματοσκοπία ηλεκτρονικού παραμαγνητικού συντονισμού (EPR). Η φασματοσκοπική μελέτη του ενζύμου στηρίχτηκε στη δέσμευση εξωγενών ligands στο σίδηρο της αίμης του καταλυτικού κέντρου του ένζυμου και στην σύγκριση των φασματοσκοπικών χαρακτηριστικών, με εκείνα πρωτεϊνών με γνωστή δομή. Από τις μελέτες αυτές αποκαλύφθηκε ότι ο αιμικός σίδηρος είναι πεντασυναρμοσμένος και βρίσκεται σε κατάσταση υψηλού spin. Από την εργασία αυτή ελήφθησαν για πρώτη φορά φασματοσκοπικά δεδομένα, τα οποία στηρίζουν την υπόθεση ότι στη πέμπτη θέση συναρμογής της αίμης υπάρχει κυστεΐνη και κατά συνέπεια η HPO lyase είναι ένα κυτόχρωμα P450.