Διαχωρισμός και ταυτοποίηση πολυδύναμων κυτταρικών σειρών από την ομφαλιοπλακουντιακή μονάδα

Abstract

The umbilical cord is an important source of stem cells for treatment of haematological and non-haematological malignancies. Worldwide, thousands of transplants are reporting using stem cells from umbilical cord blood unit, while there is a rapid increase in clinical trials with these stem cells to a greater number of diseases. In the present dissertation, all those factors which lead to the recovery and isolation of large numbers of stem cells from umbilical cord -placenta unit and the isolation of pluripotent stem cells capable of differentiating into other cell populations are studied. The advantages in the use of cord blood units as a source of stem cells for transplant are their naivety and their immunological immaturity. Main disadvantage is the small number of stem cells isolated from umbilical cord of each unit. So the basic objective of this study was to isolate as much as possible number of stem cells either with the established methods or by proposing new isolations methods. We studied the factors and circumstances in which the umbilical cord blood should be transported before the processing. Maintenance at 40C before the process and immediately processing are important factors for the recovery of a greater number of stem cells. In the present study a protocol has been evaluated which results in high RBC depletion, low post processing volume and high post thaw recovery of CD34+ haemopoietic cells using non expensive equipment and clinically approved materials. Moreover a new method on the increase in UCB cell retrieval by using a modified placental/umbilical collection method is presented. The haematopoietic and mesenchymal potential of placental blood drainage were assessed. Using this method we can obtain a different population of stem cells derived from human placenta flushing. One CD45+, CD34+ population with haematopoietic potential and another CD45-, CD34- multipotent stem cell population expressing mesenchymal markers such as CD90, CD105, CD29, CD44, that can proliferate after numerous passages and can differentiate into mesodermal lineage cells. No maternal DNA detected in placental perfusion samples indicating that these cells have fetal origin. A new method of co-culture of adipose derived stem cells (ADPCs) and cord blood stem cells were presented that can result to the pluripotent differentiation of the seconds.The isolated cells were studied using flow cytometry and were positive for markers of pluripotent stem cells (USSCs). Stem cells were also isolated from Wharton's jelly and a new approach for the isolation of mesenchymal stem cells using the total length of the umbilical cord were suggested. The method leads to the isolation of a large number of mesenchymal stem cells in total, due to the fact that more tissue is used. Multilineage differentiation to osteoblasts and adipose stem cells was evaluated. Isolated stem cells maintain their entire characteristics post thaw, which makes this method ideal for banking purposes and therapeutic uses in future.Cells isolated from the entire length of the umbilical cord were analyzed for the presence of pluripotent embryonic markers. The presence of small-sized cells in umbilical cord tissue, which have morphological and phenotypic characteristics similar to embryonic cells (VSELs) was evaluated. The isolated cells were positive for fetal markers as Nanog, Oct and CXCR4 and stained strongly with alkaline phosphatase, which is a marker of embryonic stem cells. In summary we can say that the results of this study reinforce the importance of cord blood units in the field of transplantation but also in applications of regenerative medicine. New isolation methods and new sources of haematopoitic, and pluripotent mesenchymal stem cells are proposed which will increase the use of cord blood units for therapeutic applications.

Ο ομφάλιος λώρος αποτελεί σημαντική πηγή βλαστοκυττάρων, για τη θεραπεία αιματολογικών και μη αιματολογικών ασθενειών. Παγκοσμίως πραγματοποιούνται χιλιάδες μεταμοσχεύσεις με τη χρήση βλαστοκυττάρων από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα, ενώ παρατηρείται ραγδαία αύξηση των κλινικών μελετών για την εφαρμογή τους σε μεγαλύτερο αριθμό ασθενειών. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν όλοι οι παράγοντες που θα οδηγήσουν στην ανάκτηση και απομόνωση μεγάλου αριθμού βλαστοκυττάρων από την ομφαλοπλακουντιακή μονάδα αλλά και η ύπαρξη πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων με ικανότητα διαφοροποίησης σε άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς.Η χρήση των ομφαλοπλακουντιακών μονάδων έναντι άλλων πηγών μεταμοσχεύσεων πλεονεκτεί καθώς τα κύτταρα αυτά είναι πιο νεανικά βλαστικά κύτταρα του οργανισμού και επιπλέον πιο ανώριμα ανοσολογικά. Βασικό μειονέκτημα αποτελεί ο μικρός αριθμός βλαστικών κυττάρων που απομονώνονται από κάθε ομφαλοπλακουντιακή μονάδα. Βασικός στόχος της μελέτης ήταν η απομόνωση μεγαλύτερου αριθμού βλαστοκυττάρων τόσο με τις καθιερωμένες μεθόδους λήψης όσο και με νέες μεθόδους. Μελετήθηκαν οι παράγοντες και οι συνθήκες στις οποίες πρέπει το ομφαλοπλακουντιακό αίμα να μεταφέρεται μέχρι την επεξεργασία. Διαπιστώθηκε ότι διατήρηση στους 40C αλλά και η άμεση επεξεργασία για την απομόνωση ομφαλοπλακουντιακών μοσχευμάτων αποτελούν σημαντικούς παράγοντες της ανάκτησης του μεγαλύτερου αριθμού βλαστοκυττάρων. Εφαρμόστηκε διαδικασία επεξεργασίας των βλαστοκυττάρων από το ομφαλοπλακουντιακό αίμα που οδηγεί σε ποσοστά ανάκτησης βλαστοκυττάρων μικρού τελικού όγκου και υψηλής απομάκρυνσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων χρησιμοποιώντας υλικά κατάλληλα για κλινικές μελέτες. Παράλληλα εφαρμόστηκε πρωτοποριακή μέθοδος απομόνωσης βλαστοκυττάρων από το εσωτερικό του πλακούντα. Έγινε αποστράγγιση του αίματος του πλακούντα που οδηγεί σε μεγαλύτερο αριθμό αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων αλλά και πολυδύναμων κυττάρων ικανών για διαφοροποίηση σε άλλες κυτταρικές σειρές. Με τη νέα τεχνική λαμβάνονται τουλάχιστον δυο διαφορετικοί πληθυσμοί βλαστικών κυττάρων. Ένας CD34+, CD45+αιμοποιηιτικός πληθυσμός με δυνατότητες δημιουργίας όλων των αιμοποιητικών σειρών και ένας CD34-, CD45- πληθυσμός που εκφράζει μεσεγχυματικούς δείκτες, όπως CD90, CD105, CD29, CD44, και δυνατότητα διαφοροποίησης προς άλλους ιστούς του μεσοδέρματος. Η νέα ποσότητα ομφαλοπλακουντιακού αίματος που λαμβάνεται είναι εμβρυϊκής προέλευσης καθώς δε διαπιστώθηκε επιμόλυνση από μητρικό αίμα. Παράλληλα απομονώθηκαν πολυδύναμα βλαστοκύτταρα από τον ομφάλιο λώρο με τη προσθήκη βλαστικών κυττάρων από το λιπώδη ιστό. Τα κύτταρα που απομονώθηκαν μελετήθηκαν με τη βοήθεια κυτταρομετρίας ροής και ήταν θετικά σε δείκτες που εκφράζουν τα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (USSCs). Απομονώθηκαν βλαστοκύτταρα από τη γέλη του Wharton και εφαρμόστηκε μια νέα τεχνική απομόνωσης μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων από ολόκληρο το μήκος του ομφαλίου λώρου. Με τη νέα τεχνική απομονώνονται περισσότερα μεσεγχυματικά κύτταρα από τον ιστό του ομφάλιου λώρου. Κύτταρα που απομονώθηκαν διαφοροποιήθηκαν σε οστικά κύτταρα και λιποκύτταρα. Τα βλαστικά κύτταρα διατήρησαν τα χαρακτηριστικά τους κατά τη διάρκεια των ανακαλλιεργειών και μετά την απόψυξη. Κύτταρα που απομονώθηκαν από ολόκληρο το μήκος του ομφαλίου λώρου ελέχθησαν για την ύπαρξη πολυδύναμων εμβρυϊκών δεικτών. Διαπιστώθηκε η παρουσία μικρών σε μέγεθος κυττάρων στον ιστό του ομφαλίου λώρου που παρουσιάζουν μορφολογικά και φαινοτυπικά χαρακτηριστικά παρόμοια με αυτά των εμβρυϊκών κυττάρων (VSELs). Τα κύτταρα που απομονώθηκαν ήταν θετικά για τους εμβρυϊκούς δείκτες Oct CXCR4 και Nanog ενώ χρωματίζονται έντονα με την αλκαλική φωσφατάση, χρωστική που χαρακτηρίζει και τα εμβρυϊκά πολυδύναμα κύτταρα. Συνοψίζοντας μπορούμε να πούμε ότι τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής ενισχύουν τη σημασία των ομφαλοπλακουντιακών μονάδων στο πεδίο των μεταμοσχεύσεων αλλά και στις εφαρμογές της αναγεννητικής ιατρικής. Νέες μέθοδοι απομόνωσης αλλά και νέες πηγές αιμοποιητικών, μεσεγχυματικών και πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων προτείνονται οι οποίες θα αυξήσουν τη χρήση των ομφαλοπλακουντιακών μονάδων για θεραπευτικές εφαρμογές.