Ο ρόλος των πρωτεϊνών του συμπλέγματος της πρωτεΐνης SARA στη μεταγωγή του σήματος και τη βιολογική δραστικότητα του TGFβ-ακτιβίνης: η πρωτεΐνη RNF11

Abstract

Enormous progress has been made in our understanding on how different families of growth factors (GFs) transduce signals from their receptors in plasma membrane to the nucleus. The accumulated knowledge suggested that spatio-temporal regulation of signaling components plays an important role in the signaling outcome. Indeed, every signaling receptor undergoes internalization by one of at least five different entry routes of endocytosis, clathrin-mediated endocytosis being the most known. Cargo, entering via these alternative routes, is transported to a series of intracellular compartments from where it is either recycled to the cell surface via recycling endosomes or directed to degradative compartments (late endosomes and lysosomes). Selective trafficking of membrane proteins to lysosomes requires the ESCRT (Endosomal sorting complex required for transport) machinery. The first component of this machinery, ESCRT-0, consists of Hrs, STAM and Eps15b, three proteins with ubiquitin-binding domains that recognize ubiquitinated cargos destined for lysosomal degradation thereby preventing their recycling and retrograde trafficking.SARA is a FYVE domain-containing protein that resides mainly on early endosomes and appears to regulate directly both signaling and trafficking in the endocytic compartment. Previous studies of our laboratory have identified SARA-interacting proteins. Among them, we found RNF11, a modular 154aa-containing Ring-H2 E3 ligase, harboring a PY motif and a RING-H2 domain. RNF11 interacts with ubiquitin E3 ligases and numerous other proteins exerting functions in signal transduction and protein ubiquitination.In the present study, we have biochemically validated the interaction between RNF11 and SARA. In support, we found that RNF11 exhibited considerable colocalization with SARA on early endosomes, residing on the membranes of the endocytic compartment, mostly in early and late endosomes, but also in the fast recycling compartment. The association of RNF11 with SARA was not responsible for the endocytic localization of RNF11. However, N-myristoylation and rapid endocytosis contribute to the accumulation of RNF11 in early endosomes.Mapping of the interaction domains revealed that the aa from 59-95 and the RING-H2 domain, are important for the RNF11 interaction with SARA. In functional terms, the RNF11 decreased SARA protein levels , predominantly by lysosomal and not proteosomal degradation.Moreover, the SARA/RNF11 complex is associated with the ESCRT-0 core proteins, participating in sorting of EGFR for degradation. Indeed, RNF11 interacted with HRS, STAM2 and Eps15b, strongly indicating that the well-characterized ESCRT-0 complex, comprising Hrs and STAM2, might include also RNF11. However, we were not able to detect any co-immunoprecipitation of SARA with Hrs, a result suggesting that the two FYVE domain proteins, Hrs and SARA, do not exist in the same complex. The fact that, SARA co-immunoprecipitated with STAM2 and over-expressed SARA, STAM2 and Eps15b were all co-immunoprecipitated by RNF11 from the same cell lysate suggested that an alternative assembly could exist, consisting of SARA, STAM2, Eps15b and RNF11. The last scenario is further supported by the observation that clathrin and SARA interact with pull down assay. Overexpression and depletion of either SARA or RNF11 delayed degradation of EGF-activated EGFR, exhibiting a bell-shaped behavior characteristic for the known ESCRT-0 components, Hrs and Eps15b. Moreover depletion of RNF11 enhanced EGF recycling, whereas depletion of SARA did not. Both of them however, increased the duration of the EGF-mediated phosphorylation of ERK. To summarize, SARA and RNF11 interact with each other and with the ESCRT-0 core proteins participating in lysosomal trafficking and degradation of cargos such as the EGFR. These results define a novel and unexpected function for SARA and RNF11 in MVE function

Τα τελευταία χρόνια, το ενδιαφέρον πολλών ερευνητών έχει επικεντρωθεί στη διαλεύκανση των μηχανισμών μετάδοσης μηνυμάτων από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων και στη σχέση τους με την ενδοκυττάρωση και την κυστιδιακή μεταφορά. Οι ενεργοποιημένοι υποδοχείς (φορτίο) εισέρχονται στο κύτταρο με διάφορους τρόπους, με πιο γνωστή την κλαθρινο-εξαρτώμενη ενδοκυττάρωση (CDE). Tο φορτίο, μετά την είσοδό του μέσα στο κύτταρο φτάνει στο πρώιμο ενδόσωμα και από εκεί, είτε επιστρέφει στη μεμβράνη, μέσω των ενδοσωμάτων ανακύκλωσης, είτε αποικοδομείται μέσω των πολυκυστιδιακών σωματιδίων (MVB) και των λυσοσωμάτων. Στην τελευταία διαδικασία διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο πρωτεϊνικά συμπλέγματα, γνωστά ως ESCRT (Endosomal sorting required for transport). Το πρώτο από αυτά, το ESCRT-0, αποτελείται από τις HRS, STAM2 και την επικουρική Eps15b και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αναγνώριση των ουβικιτινιωμένων υποδοχέων και τη μετέπειτα παράδοση τους στα ESCRT-I, -II και -IΙI. Στη συνέχεια οι υποδοχείς ενσωματώνονται στη μεμβράνη ενδοαυλικών κυστιδίων (ILV) των MVB και τελικά παραδίδονται στα λυσοσώματα για αποικοδόμηση.Η SARA είναι μια πρωτεΐνη με FYVE περιοχή, που εντοπίζεται στο πρώιμο ενδόσωμα και φαίνεται να συμμετέχει τόσο στη κυστιδιακή διακίνηση, όσο και στη μεταγωγή σήματος από τους υποδοχείς της οικογένειας του TGFβ. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου στο οποίο εκπονήθηκε η διατριβή, ανίχνευσαν την πρωτεΐνη RNF11 να αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη SARA. Η πρωτεΐνη RNF11 είναι μια RING-H2 λιγάση, η οποία διαθέτει ένα PY μοτίβο και μια RING δομική περιοχή και έχει αναφερθεί να συμμετέχει σε διαδικασίες πρωτεϊνικής ουβικιτίνωσης και μεταγωγής σήματος. Στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε με βιοχημικές μεθόδους πως οι πρωτεΐνες RNF11 και SARA αλληλεπιδρούν. Μελέτες που αφορούν την κυτταρική διαμερισματοποίηση της πρωτεΐνης RNF11, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη RNF11 εντοπίζεται στο πρώιμο, στο όψιμο και στο γρήγορης ανακύκλωσης ενδόσωμα. Οι πρωτεΐνες RNF11 και SARA συνεντοπίζονται στο πρώιμο ενδόσωμα, ωστόσο η SARA δεν ευθύνεται για την ενδοσωματική στόχευση της RNF11. Για την διαμερισματοποίηση της πρωτεΐνης RNF11 στο πρώιμο ενδόσωμα είναι σημαντικές τροποποιήσεις ακυλιώσεων στο αμινοτελικό της άκρο και η γρήγορη ενδοκυττάρωσή της από την κυτταρική μεμβράνη. Χαρτογράφηση της περιοχής αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών, έδειξε ότι είναι απαραίτητα, τόσο τα αα από το 59-95, όσο και η RING δομική περιοχή της πρωτεΐνης RNF11. Από λειτουργική σκοπιά, η πρωτεΐνη RNF11 προκαλεί τη λυσοσωματική και όχι την πρωτεασωμική αποικοδόμηση της πρωτεΐνης SARA.Επιπρόσθετα οι πρωτεΐνες RNF11 και SARA βρέθηκαν να αλληλεπιδρούν με τα μέλη του ESCRT-0 συμπλέγματος. Πράγματι, η RNF11 αλληλεπιδρά με τις HRS, STAM και Eps15b, παρατήρηση που μας οδηγεί στο συμπέρασμα πως η πρωτεΐνη RNF11 είναι ένα ακόμη μέλος του ESCRT-0. Επιπρόσθετα, η RNF11 συν-κατακρημνίζει ταυτόχρονα τις STAM2, SARA και Eps15b. Η παραπάνω παρατήρηση σε συνδυασμό το ότι η πρωτεΐνη SARA αλληλεπιδρά με την STAM2 αλλά όχι με την HRS, μας οδήγησε στο συμπέρασμα πως, ενδεχομένως, σχηματίζεται ένα εναλλακτικό ESCRT-0 σύμπλεγμα ανάμεσα στις SARA/RNF11/STAM2/Eps15b, στο οποίο δεν εμπεριέχεται η HRS. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται και από την παρατήρηση ότι η SARA βρέθηκε να αλληλεπιδρά και με την πρωτεΐνη κλαθρίνη.Ο ενεργοποιημένος υποδοχέας EGFR αποτελεί ένα τυπικό ουβικιτινιωμένο φορτίο που αναγνωρίζεται από το ESCRT σύμπλεγμα και υφίσταται λυσοσωματική αποικοδόμηση. Σε συμφωνία με την υπερέκφραση ή την εξάλειψη των επιπέδων των πρωτεϊνών HRS και Eps15b, η απορύθμιση των επιπέδων των πρωτεϊνών RNF11 και SARA έχει ως αποτέλεσμα τη μειωμένη αποικοδόμηση του υποδοχέα EGFR. Στην περίπτωση της εξάλειψης της πρωτεΐνης RNF11 παρατηρείται και αυξημένη ανακύκλωση του EGF προς την μεμβράνη, ενώ κάτι τέτοιο δεν παρατηρείται στην περίπτωση της εξάλειψης της πρωτεΐνης SARA. Ωστόσο και στις δύο περιπτώσεις παρατηρείται παρατεταμένη ενεργοποίηση της ERK. Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει πως οι πρωτεΐνες RNF11 και SARA αλληλεπιδρούν μεταξύ τους καθώς και με τα μέλη του ESCRT-0 συμπλέγματος και συμμετέχουν, ενεργά, στη διαδικασία διαλογής του υποδοχέα EGFR για αποικοδόμηση.