Μελέτη του ρόλου του μορίου της Geminin στον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση και διαφοροποίηση πολυδύναμων κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας σε γενετικά τροποποιημένους μύες

Abstract

The neural crest is a multipotent cell population that is formed at the dorsal neural tube of vertebrate embryos during neurulation. After their formation, neural crest cells (NCCs) delaminate from the neural tube and migrate throughout the embryo following specific pathways, and give rise to a wide variety of structures, such as neural and glial cells of the peripheral nervous system (PNS), melanocytes, structures of the craniofacial skeleton, etc. Neural crest formation, self-renewal and differentiation require the coordination of proliferation and differentiation. Deregulation of these processes results in developmental diseases in humans, known as neurocristopathies. Geminin is a molecule that has the ability to regulate cell cycle progression and differentiation, through interactions with the licensing factor Cdt1, transcription factors and chromatin remodeling factors. Previous studies from our laboratory have shown that Geminin is an important regulator of self-renewal and differentiation of early cortical progenitors. In order to understand the mechanisms that control self-renewal and differentiation of multipotent neural crest cells (NCCs) and gain insight into the molecular mechanism of human diseases, we studied the role of Geminin in the formation, self-renewal and differentiation of NCCs. Towards this direction, we performed in vivo and in vitro experiments, using animal models that have been generated in our laboratory and allow the conditional inactivation of Geminin in neural crest cells. Our results showed that deletion of Geminin causes severe morphological malformations in embryos that are characterized by the absence of midbrain, branchial arches and severe craniofacial malformation. Mutant embryos are dying a few days before birth. Moreover, during early embryonic development, the neural crest-derived structures, such as cranial and dorsal root ganglia, the maxillary and the mandibular components, and enteric progenitor cells, were severely affected. The decrease of enteric neural crest cells resulted in the formation of aganglionic gut that resembles with the phenotype of Hirschsprung disease. The conditional inactivation of Geminin resulted in the decreased formation of naïve vagal neural crest cells, while enteric neural crest cells were dramatically reduced. Geminin deficient enteric neural crest sells show increased apoptosis at E9.5 and E10.5, and decreased cell proliferation at E9.5. These findings, combined with the decreased self-renewal capacity of enteric progenitor cells (EPCs) in vitro, suggest that Geminin is important for the self-renewal and the survival of ENS progenitor cells. In addition, deletion of Geminin resulted in decreased committed enteric neural crest cells that express enteric progenitor markers Phox2b, Ret and Mash1. In conclusion, our results highlight Geminin as an important molecule during the formation of multipotent neural crest cells. Geminin is required for the formation of vagal neural crest cells that colonize the gastrointestinal tract, and regulates survival and self-renewal of these cells, as well as their transition from a multipotent state to the committed enteric lineage of progenitor cells. Moreover, conditional inactivation of Geminin leads to Hirschsprung-like phenotype that could be used as model organisms to study disease pathogenesis and help in the discovery of new therapies.

Τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας είναι ένας πολυδύναμος πληθυσμός βλαστικών κυττάρων που δημιουργείται στη ραχιαία πλευρά του νευρικού σωλήνα των σπονδυλωτών κατά τη διάρκεια της νευριδίωσης. Μετά τη δημιουργία τους, τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας μεταναστεύουν σε ολόκληρο το έμβρυο, ακολουθώντας συγκεκριμένα μονοπάτια, συνεισφέροντας στη δημιουργία μιας μεγάλης ποικιλίας δομών, όπως νευρικά και γλοιακά κύτταρα του περιφερικού νευρικού συστήματος (ΠΝΣ), μελανοκύτταρα, δομές που συμβάλλουν στο σκελετό του κρανίου και του προσώπου κλπ. Η δημιουργία, η αυτο- ανανέωση και η διαφοροποίηση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας απαιτούν το συντονισμό των διεργασιών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Η αδυναμία συντονισμού των παραπάνω διαδικασιών οδηγεί στην εμφάνιση ασθενειών στον άνθρωπο (neurocristopathies). Η Geminin είναι ένα μόριο που έχει την ικανότητα να ρυθμίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, αλληλεπιδρώντας με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1, και τη διαφοροποίηση, μέσω της αλληλεπίδρασής της με μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν αναδείξει τη Geminin ως ένα σημαντικό ρυθμιστή των διαδικασιών της αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης στα πρόδρομα νευρικά κύτταρα στον αναπτυσσόμενο φλοιό. Προκειμένου να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που ελέγχουν την αυτο-ανανέωση και τη διαφοροποίηση των πολυδύναμων κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας και να κατανοήσουμε το μοριακό μηχανισμό ασθενειών στον άνθρωπο που σχετίζονται με την απορρύθμιση του ελέγχου της ικανότητας αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης των πολυδύναμων κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας μελετήσαμε το ρόλο της Geminin στη δημιουργία, την αυτο-ανανέωση, τον καθορισμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας. Προς αυτή την κατεύθυνση πραγματοποιήθηκαν τόσο in vivo όσο και in vitro πειράματα, χρησιμοποιώντας ζωικά μοντέλα τα οποία δημιουργήθηκαν από το εργαστήριο μας και στα οποία το γονίδιο της Geminin είχε αδρανοποιηθεί ειδικά στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η απουσία της Geminin οδηγεί στη δημιουργία εμβρύων με σοβαρές μορφολογικές αλλοιώσεις, που κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια χαρακτηρίζονται από την απουσία της δομής του μεσεγκεφάλου και των βραγχιακών τόξων και σε μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια εμφανίζουν σοβαρή κρανιοπροσωπική δυσμορφία, με κατάληξη το θάνατο των εμβρύων, λίγες ημέρες πριν γεννηθούν. Επιπλέον, κατά τα πρώιμα αναπτυξιακά στάδια παρατηρήθηκαν σοβαρές αλλοιώσεις σε δομές που προέρχονται από τη νευρική ακρολοφία, όπως είναι τα κρανιακά και τα ραχιαία γάγγλια, οι γναθικές προεκβολές και τα πρόδρομα κύτταρα του εντερικού νευρικού συστήματος. Η μείωση του πληθυσμού των πρόδρομων κυττάρων του εντερικού νευρικού συστήματος (ΕΝΣ) οδήγησε στη δημιουργία ενός αγαγγλιονικού εντέρου, το οποίο παρομοιάζει με το φαινότυπο του ΕΝΣ στη νόσο Hirschsprung στον άνθρωπο. Η ιστοειδική αδρανοποίηση της Geminin οδήγησε στη μείωση των αδιαφοροποίητων κυττάρων νευρικής ακρολοφίας που δημιουργούνται στην αυχενική περιοχή του νευρικού σωλήνα και στην είσοδο μικρότερου αριθμού κυττάρων νευρικής ακρολοφίας στον γαστρεντερικό σωλήνα κατά τα πρώτα στάδια του αποικισμού του. Μελέτη των εντερικών κυττάρων νευρικής ακρολοφίας έδειξε ότι η αποσιώπηση της Geminin προκάλεσε την αύξηση της απόπτωσης κατά τις ηλικίες Ε9.5 και Ε10.5 και τη μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού τους κατά την ηλικία Ε9.5. Σε συνδυασμό με τη μειωμένη ικανότητα που δείχνουν τα πρόδρομα εντερικά κύτταρα να αυτο-ανανεώνονται, τα αποτελέσματά μας προτείνουν ότι η Geminin έχει σημαντικό ρόλο στην αυτο-ανανέωση και την επιβίωση των πρόδρομων κυττάρων του ΕΝΣ. Επιπλέον, η απουσία της Geminin οδηγεί στη μείωση των κυττάρων που έχουν καθορισμένη μοίρα και εκφράζουν τους δείκτες των πρόδρομων εντερικών κυττάρων Phox2b, Ret και Mash1, ενώ τα κύτταρα αυτά απουσία της Geminin παρουσιάζουν μειωμένη παραγωγή νευρικών κυττάρων, κατά την έναρξη της νευρωνικής διαφοροποίησης. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν τη Geminin ως ένα σημαντικό μόριο κατά τη δημιουργία των πολυδύναμων κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας. Επίσης η Geminin είναι απαραίτητη για τη δημιουργία των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας που αποικίζουν το γαστρεντερικό σωλήνα, ενώ ρυθμίζει την επιβίωση και την αυτο-ανανέωσή τους, καθώς και τη μετάβασή τους από την αρχικά αδιαφοροποίητη/πολυδύναμη κατάσταση στην εντερική αναπτυξιακή μοίρα. Επιπλέον η απουσία της Geminin δημιουργεί μύες οι οποίοι μιμούνται τη νόσο του Hirschsprung και αποτελούν ένα σημαντικό ζωικό μοντέλο για τη μελέτη των μηχανισμών της μοριακή παθογένειας της νόσου αλλά και στην εύρεση νέων θεραπειών.