Επίδραση της ηλικίας του δότη στην απόκριση ανθρώπινων περιοδοντικών ινοβλαστών σε μηχανική διέγερση

Abstract

Introduction Orthodontic movement is achieved by means of bone resorption and formation as the teeth respond to mechanical forces during treatment. The main mediators of mechanical stress to the alveolar bone are the cells of the periodontal ligament (PDL). The PDL consists of an heterogeneous cell population comprised by non-differentiated multipotent mesenchymal cells, as well as fibroblasts. The periodontal fibroblasts have the capacity to differentiate into osteoblasts in response to various external mechanical stimuli. This feature of the PDL fibroblasts plays a key role in the regeneration of the alveolar bone and the acceleration of orthodontic movement. Despite the importance of this phenomenon, the number of publications on the molecular response of human periodontal fibroblasts, after mechanical stimulation and on the subsequent activation of signaling pathways, is limited. Furthermore, there are no studies investigating at a molecular level the role of aging to the response to mechanical stretching that different age groups have as far as signaling pathways and osteoblastic differentiation are concerned. Objective The purpose of this study was to investigate the effects of cyclic mechanical stress on the activation of signaling pathways and on the expression of genes associated with the differentiation of fibroblasts of the periodontal ligament. Specifically, we studied the effect of aging on the proliferative capacity and osteoblastic differentiation of the PDL fibroblasts as well as on the expression of transcription factors that have been linked to the differentiation process. Additionally, the short and long-term effects of cyclic mechanical stress on the expression of genes associated with PDL fibroblast osteoblastic differentiation was also investigated. Materials and Methods Human teeth of three different age group donors - children, adolescents and adults - extracted in the course of orthodontic treatment, without labored clinical procedure, were gathered. The PDL tissue explants detached from the apical third of the roots were utilized to develop primary cultures of fibroblasts. To determine the percentage of PDL fibroblast cells which can proliferate, the DNA synthesis was quantified by estimating the BrdU incorporation. Additionally, the isolated periodontal fibroblasts incubated for 20 days to osteogenic medium and their ability towards osteoblastic differentiation was assessed by their production of calcified matrix. The fibroblasts were subjected to cyclic mechanical stress for periods of 0,5 to 6 hours and the expression of c-fos, Runx2, osx and ALP at the mRNA level was estimated. The activation of MAPK signaling pathways was also studied by using Western analysis and specific inhibitors were utilized to determine the important ones on the the expression of the transcription factor c-fos. Results The primary fibroblasts cultures from all age group donors have increased BrdU incorporation rates and therefore DNA synthesis capacity and cell proliferation, indicating no accumulation of senescent cells, at least in the cultures of the age groups. In each age group we identified cultures able for the production of calcified matrix (indicating osteoblastic differentiation) and others that do not. Interestingly, there were no major changes between those age groups studied. Next, we studied the short-term effect of the cyclic mechanical stress on the expression, at the mRNA level (studied by qRT-PCR), of transcription factors and other genes involved in the osteoblastic differentiation. It was observed that the short-term stimulation induces the immediate (within the first 30 minutes of the stress application) and intense expression of the transcription factor c-fos. It does not seem though to affect the expression of the two other important transcription factors, Runx2 and osx, which control the osteoblastic differentiation at least for the period from 0 to 6 hours. Furthermore, in PDL fibroblasts were subjected to cyclic mechanical stress for 3 days, there was no observation of increased expression levels of the three transcription factors, Runx2, osx, c-fos and the bone-specific marker ALP. By using Western analysis we found that mechanical stimulation led to the activation of all MAPKs (ERK, SAPK/JNK and p38) by phosphorylation. This activation was immediate, starting 15 minutes after initiation of cell stretching. Furthermore, this stimulus provoked phosphorylation of the transcription factor c-Jun, a component of the AP-1 transcription complex. Interestingly, mechanical stretching provoked MAPK activation also in cells that were unable to differentiate, indicating that other factors (beyond MAPK) are also needed for the complete osteoblastic differentiation. Finally, by using specific MAPK inhibitors we studied the effect of these signaling on the stress-mediated induction of c-fos. We found that by inhibiting the ERK and SAPK/JNK kinases a partial decrease in c-fos was observed, indicating that the mechanical stimulus leads to the up-regulation of c-fos, at least partially, via the activation of these signaling pathways. Conclusions In this study we investigated the effect of cyclic mechanical stimulation on signaling pathways and transcription factors in primary cultures of PDL fibroblast from donors of various ages (from children to adults). We found that all cultures had similar percentages of young cells able to proliferate. Furthermore, there were no major differences in the ability of PDL towards osteoblastic differentiation between these age groups. Mechanical stimulation, activate immediately the ERK, SAPK/JNK and p38 MAPK pathways. Furthermore, ERK and SAPK/JNK activation can lead to the up-regulation of the transcription factor c-fos. In contrast, the expression of Runx2 and osx is not upregulated by cyclic mechanical stimulation. The data cumulatively indicate that cyclic mechanical stimulation activates signaling pathways involved in the regulation of the osteoblastic differentiation of PDL fibroblasts.

Εισαγωγή Η ορθοδοντική μετακίνηση οφείλεται στην ικανότητα του φατνιακού οστού να αναδιαμορφώνεται. Η διαδικασία αναδιαμόρφωσης του οστού ελέγχεται από μια ισορροπία μεταξύ της οστικής σύνθεσης στις περιοχές που το περιοδόντιο υφίσταται τάση και απορρόφησης στις περιοχές που υφίσταται πίεση. Τα δόντια κατά τη διάρκεια της θεραπείας αποκρίνονται στις μηχανικές δυνάμεις μεταδίδοντας τες στα κύτταρα του περιοδοντικού συνδέσμου (ΠΔΣ). Ο ΠΔΣ περιλαμβάνει έναν ετερογενή κυτταρικό πληθυσμό που αποτελείται μεταξύ άλλων από ινοβλάστες καθώς και από μη διαφοροποιημένα πολυδύναμα μεσεγχυματικά κύτταρα. Οι ινοβλάστες αποκρινόμενοι σε εξωγενή μηχανικά ερεθίσματα μέσω ειδικών σηματοδοτικών μονοπατιών έχουν την ικανότητα οστεοβλαστικής διαφοροποίησης συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στην οστική αναδιαμόρφωση και την επακόλουθη ορθοδοντική μετακίνηση. Παρά τη σημασία αυτού του βιολογικού φαινομένου ο αριθμός των σχετικών εργασιών είναι περιορισμένος. Επιπλέον, δεν υπάρχουν μελέτες που εξετάζουν σε μοριακό επίπεδο το ρόλο της γήρανσης στην απόκριση των ινοβλαστών του ΠΔΜ διαφορετικών ηλικιακών ομάδων σε αυτά τα μηχανικά ερεθίσματα, όσον αφορά στη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών και στην έκφραση μορίων που σχετίζονται με την οστεοβλαστική διαφοροποίηση. Σκοπός Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της ηλικίας στην ενεργοποίηση κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών και στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών του ΠΔΣ σε μηχανική διέγερση. Συγκεκριμένα, εξετάσαμε την επίδραση της ηλικίας στην πολλαπλασιαστική ικανότητα και την οστεοβλαστική διαφοροποίηση των ινοβλαστών του ΠΔΣ καθώς και στην έκφραση μεταγραφικών παραγόντων σχετιζόμενων με τη διαδικασία διαφοροποίησης. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η βραχυπρόθεσμη και μακροπρόθεσμη επίδραση του επαναλαμβανόμενου μηχανικού στρες στην έκφραση γονιδίων που ενέχονται στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση των ινοβλαστών του ΠΔΣ. Τέλος , διερευνήθηκε το ενδοκυτταρικό σηματοδοτικό μονοπάτι των MAPK κινασών που ευθύνεται για την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα c-fos κατά την άσκηση επαναλαμβανόμενου μηχανικού στρες. Υλικά και μέθοδοι Συνελέγησαν δόντια, προγραμματισμένα να αφαιρεθούν για ορθοδοντικούς λόγους, από διαφορετικές ηλικιακές ομάδες: παιδιά, εφήβους και ενήλικες άνω των 30 ετών . Η συλλογή περιορίστηκε σε άθικτα, υγιή δόντια (κυρίως προγομφίους) της άνω και κάτω γνάθου των οποίων το περιοδόντιο δεν είχε στοιχεία φλεγμονής. Οι εξαγωγές διεξήχθησαν με κατά το δυνατόν άσηπτο τρόπο και χωρίς εργώδη κλινική πράξη. Τεμαχίδια ιστού του ΠΔΣ από το τελευταίο τρίτο της ρίζας των δοντιών χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη πρωτογενών καλλιεργειών ινοβλαστών (PDL fibroblasts). Για να προσδιοριστεί το ποσοστό των ινοβλαστών του ΠΔΣ που έχουν πολλαπλασιαστική ικανότητα σε κάθε ηλικιακή ομάδα έγινε ποσοτικός προσδιορισμός σύνθεσης DNA μέσω της μεθόδου ενσωμάτωσης βρωμοδεοξυουριδίνης (BrdU). Στη συνέχεια, περιοδοντικοί ινοβλάστες απομονώθηκαν από όλες τις ηλικιακές ομάδες και επωάστηκαν επί 20 ημέρες με κατάλληλο οστεογενετικό υλικό. H ικανότητα των ινοβλαστών προς οστεοβλαστική διαφοροποίηση εκτιμήθηκε με βάση τη παραγωγή ασβεστοποιημένης μήτρας με χρώση Von Kossa. Οι ινοβλάστες του ΠΔΣ υπεβλήθησαν σε περιοδικό μηχανικό στρες για χρονικές περιόδους από 0,5 έως 6 ώρες. Στο τέλος κάθε χρονικού διαστήματος έγινε συλλογή των κυτταρικών λυμάτων με κατάλληλο χαοτροπικό διάλυμα (Trizol), απομόνωση και καθαρισμός του RNA των κυττάρων, σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας DNA (cDNA) με τη μεθοδολογία της αντίστροφης μεταγραφής σε συνδυασμό με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και τέλος ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR) για τον έλεγχο της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων c-fos, Runx2, osx και ALP.Η ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών των MAPK κινασών διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση κατά Western. Ειδικοί αναστολείς χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν τη σημαντικότητα κάθε MAPK μονοπατιού στην έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα c-fos. Αποτελέσματα Οι καλλιέργειες των πρωτογενών ινοβλαστών, από όλες τις ηλικιακές ομάδες, έδειξαν αυξημένη ικανότητα ενσωμάτωσης βρωμοδεοξυουριδίνης και συνεπώς αυξημένη ικανότητα σύνθεσης DNA και κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Δεν παρατηρήθηκαν συσσωρεύσεις γηρασμένων κυττάρων σε καμία ηλικιακή ομάδα. Σε κάθε ηλικιακή ομάδα προσδιορίστηκαν καλλιέργειες ικανές να παράγουν ασβεστοποιημένη μήτρα (υποδεικνύοντας οστεοβλαστική διαφοροποίηση) και άλλες που στερούνταν αυτής της ικανότητας. Συνοψίζοντας, δεν παρατηρήθηκε καμμία σημαντική διαφορά ανάμεσα στις ηλικιακές ομάδες που εξετάστηκαν. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η βραχυπρόθεσμη επίδραση του επαναλαμβανόμενου μηχανικού στρες στην έκφραση, σε επίπεδο mRNA (μέσω qRT-PCCR), μεταγραφικών παραγόντων και άλλων γονιδίων που ενέχονται στην οστεοβλαστική διαφοροποίηση. Παρατηρήθηκε ότι η βραχυπρόθεσμη διέγερση επάγει την άμεση (σε 30’ από την εφαρμογή της διέγερσης) και έντονη έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα c-fos. Δεν φάνηκε πάντως να επηρεάζει την έκφραση των δύο άλλων μεταγραφικών παραγόντων Runx2 και osx οι οποίοι ελέγχουν την οστεοβλαστική διαφοροποίηση τουλάχιστον για τη χρονική περίοδο από 0 έως 6 ώρες. Επιπλέον, σε ινοβλάστες του ΠΔΣ που εκτέθηκαν σε επαναλαμβανόμενο μηχανικό στρες για 3 ημέρες δεν παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση των τριών μεταγραφικών παραγόντων Runx2, osx, c-fos και του οστεοειδικού δείκτη ALP. Χρησιμοποιώντας ανάλυση κατά Western διαπιστώσαμε ότι η μηχανική διέγερση οδήγησε σε ενεργοποίηση όλων των σηματοδοτικών μονοπατιών των MAPK (ERK, SAPK/JNK, p38) μέσω φωσφορυλίωσης. Αυτή η ενεργοποίηση ήταν άμεση, ξεκινώντας 15 λεπτά μετά την εφαρμογή της μηχανικής διέγερσης των κυττάρων. Επιπροσθέτως, το μηχανικό αυτό ερέθισμα προκάλεσε φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα c-Jun, συστατικό του μεταγραφικού συμπλέγματος AP-1. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση ήταν η μετά από μηχανική διέγερση ενεργοποίηση των MAPK και σε κύτταρα που στερούνται της ικανότητας οστεοβλαστικής διαφοροποίησης. Συμπεραίνεται συνεπώς ότι και άλλοι παράγοντες (πέραν των MAPK) είναι απαραίτητοι για την ολοκλήρωση της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης.Εν τέλει, χρησιμοποιώντας ειδικούς MAPK αναστολείς εξετάστηκε η επίδραση αυτών των σηματοδοτικών μονοπατιών στην επαγωγή, υπό μηχανική διέγερση ,του μεταγραφικού παράγοντα c-fos. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αναστέλλοντας τις ERK και SAPK/JNK κινάσες, παρατηρήθηκε μερική μείωση του c-fos. Υποδεικνύεται λοιπόν, η υπό μηχανική διέγερση πλειορύθμιση του c-fos πραγματοποιείται (τουλάχιστον μερικώς), μέσω της ενεργοποίησης των συγκεκριμένων σηματοδοτικών μονοπατιών. Συμπεράσματα Στην παρούσα ερευνητική εργασία εξετάσαμε την επίδραση του επαναλαμβανόμενου μηχανικού στρες στα σηματοδοτικά μονοπάτια και στους μεταγραφικούς παράγοντες σε πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών του ΠΔΣ δοτών διαφορετικών ηλικιακών ομάδων (από παιδιά έως ενήλικες). Όλες οι καλλιέργειες είχαν παρόμοια ποσοστά κυττάρων με ικανότητα πολλαπλασιασμού. Δεν παρατηρήθηκαν μεγάλες διαφορές στην ικανότητα οστεοβλαστικής διαφοροποίησης των ινοβλαστών του ΠΔΣ μεταξύ των ηλικιακών ομάδων. Η μηχανική διέγερση προκαλεί άμεση ενεργοποίηση των μονοπατιών των ERK, SAPK/JNKκαι p38 κινασών. Επιπλέον, η ενεργοποίηση των ERK και SAPK/JNK οδηγεί σε πλειορύθμιση του μεταγραφικού παράγοντα c-fos. Αντιθέτως, η έκφραση του Runx2 και osx δεν πλειορυθμίζεται από την επαναλαμβανόμενη μηχανική διέγερση. Τα αποτελέσματα, συνολικά, υποδεικνύουν ότι η επαναλαμβανόμενη μηχανική διέγερση ενεργοποιεί σηματοδοτικά μονοπάτια που ενέχονται στη ρύθμιση της οστεοβλαστικής διαφοροποίησης των ινοβλαστών του ΠΔΣ.