Μελέτη του διαλυτού τύπου της μεμβρανικής μεταλλοπρωτεάσης MT1-MMP από περιπροσθετικούς ιστούς χαλαρών προθέσεων αρθροπλαστικής: επίδραση αναστολέων πρωτεϊνικών κινασών και κινασών ενεργοποιούμενων από μιτογόνα στην παραγωγή αυτής και άλλων μεταλλοπρωτεασών στους περιπροσθετικούς ιστούς

Abstract

The knee or hip arthroplasty endoprostheses loosening is a result of periprosthetic osteolysis caused from various factors (cytokines, enzymes etc) which are secreted from the cells occurred in periprosthetic tissues because of foreign-body reaction evoked from the fragmentation and wear of the implanted materials. It is a non inflammatory disorder that resembles to osteoarthritis. Among the factors which are implicated in the endoprostheses loosening, the extracellular matrix metalloproteinases (MMPs) are included. MMPs play an important role in the degradation of extracellular matrix and basal membrane. They are involved in normal physiological processes, such as tissue remodeling and wound healing, as well as in pathological processes such as osteolysis, tumor metastasis, periodontitis, rheumatoid arthritis etc.In the present study, a soluble type of MT1-MMP (sΜΤ1-ΜΜΡ) was investigated, in periprosthetic tissues extracts and tissue extracts from patients with various lung diseases and nasal polyposis as well. Various methods such as, western blot analysis, ELISA, immunoprecipitation, gelatin zymography, fluorometric assay, immunohistochemical analysis, RT-PCR and Northern blot analysis, were used. sΜΤ1-ΜΜΡ (57 kDa) was detected in all samples tested. This soluble type cannot form complexes with α2-macroglobulin, carries the propeptide domain and TIMP-2 which is not bound to the active site of the enzyme. ΑΡΜΑ and urokinase were not able to remove the propeptide region of sΜΤ1-ΜΜΡ. This detectable sΜΤ1-ΜΜΡ cannot be ascribed to alternative splicing. The immunohistochemical analysis revealed that ΜΤ1-ΜΜΡ is expressed in an activated form on the cell surface only in fibroblasts, whereas in all other cell types such as inflammatory cells, epithelial, endothelial and giant cells is expressed in the proenzyme form, carrying the propeptide domain. The production process of sΜΤ1-ΜΜΡ as well as its biological role remains for investigation.Endoprostheses loosening usually observed 8-10 years after the primary arthroplasty operation. In this case the surgical revision of arthroplasty is needed, a painful operation for old individuals, the most of patients which have been subjected in arthroplasty Thus today, the retardation of arthroplasty endoprostheses loosening by a pharmacologic treatment is considered of important significance. The protein and MAP kinases are considered key enzymes in cellular signaling and activation of various transcription factors, and are implicated in several pathologic processes. Their inhibitors are currently used in clinical trials. In order to approach the question whether protein and MAP kinases inhibitors would contribute in the endoprostheses loosening retardation, periprosthetic tissues were cultured in the absence and presence of protein and MAP kinases inhibitors and in the culture conditioned medium, the levels of factors which play a significant role in endoprostheses loosening, such as metalloproteinases and their inhibitors (sΜΤ1-ΜΜΡ, MMP-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, MMP-13 & TIMP-1), IL-6 και PGE2 were determined. Western blot analysis, ELISA and gelatin zymography were used for the determinations. In general, the inhibitors caused a decrease in the levels of the factors that were studied or had no effect at all. In some cases, even an increase was observed. However, in order to state safe conclusions, in respect to the ability of such inhibitors to retard the endoprostheses loosening, more experiments are needed with a larger cohort of patients.

Η χαλάρωση των τεχνητών προθέσεων αρθροπλαστικών γόνατος ή ισχίου, αποτέλεσμα περιπροσθετικής οστεόλυσης που προκαλείται από διάφορους παράγοντες (κυτταροκίνες, ένζυμα κ.ά) που εκκρίνονται από κύτταρα των περιπροσθετικών ιστών λόγω αντίδρασης ξένου σώματος με τα υλικά φθοράς των τεχνικών προθέσεων, είναι μία μη-φλεγμονώδης πάθηση που προσομοιάζει της οστεοαρθρίτιδας. Μεταξύ των παραγόντων που εμπλέκονται στη χαλάρωση των προθέσεων συγκαταλέγονται και οι μεταλλοπρωτεάσες του εξωκυττάριου χώρου (ΜΜΡs). Οι ΜΜΡs παίζουν σημαντικό ρόλο στην αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού και της βασικής μεμβράνης. Εμπλέκονται τόσο σε φυσιολογικές (ανάπλαση ιστών, επούλωση τραυμάτων) όσο και σε παθολογικές (οστεόλυση, μετάσταση καρκινικών κυττάρων, περιοδοντίτιδα, ρευματοειδή αρθρίτιδα, κ.ά.) διαδικασίες. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε ένας διαλυτός τύπος της μεμβρανικής μεταλλοπρωτεάσης-1 (sΜΤ1-ΜΜΡ) σε εκχυλίσματα περιπροσθετικών ιστών, πνευμονικών ιστών από ασθενείς με διάφορες παθήσεις των πνευμόνων καθώς και σε εκχυλίσματα πολύποδα ασθενών με ρινική πολυποδίαση. Χρησιμοποιήθηκαν διάφορες μέθοδοι, όπως ανοσοαποτύπωση western, ELISA, ανοσοκατακρήμνιση, ζυμογράφημα ζελατίνης, φθορισμομετρία, ανασοϊστοχημεία, RT-PCR και αποτύπωση Northern. H sΜΤ1-ΜΜΡ (57 kDa) ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα που εξετάστηκαν. Ο διαλυτός αυτός τύπος δεν συμπλοκοποιείται με α2-μακροσφαιρίνη, φέρει την περιοχή του προπεπτιδίου αλλά και ΤΙΜΡ-2, ο οποίος όμως δεν είναι δεσμευμένος στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Τόσο το ΑΡΜΑ όσο και η ουροκινάση δεν είχαν την ικανότητα απομάκρυνσης του προπεπτιδίου της sΜΤ1-ΜΜΡ. Η ύπαρξη της sΜΤ1-ΜΜΡ δεν φαίνεται να οφείλεται σε εναλλακτικό μάτισμα. Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι η μεμβρανική μεταλλοπρωτεάση ΜΤ1-ΜΜΡ εκφράζεται στην κυτταρική μεμβράνη ενεργοποιημένη μόνο στις ινοβλάστες, ενώ σε όλα τα υπόλοιπα κύτταρα, όπως φλεγμονώδη, επιθηλιακά, ενδοθηλιακά και γιγαντοκύτταρα εκφράζεται στη μορφή του προενζύμου με το προπεπτίδιο. Ο τρόπος παραγωγής της sΜΤ1-ΜΜΡ όπως και ο βιολογικός της ρόλος παραμένουν πρός διερεύνηση. Χαλάρωση των προθέσεων παρατηρείται συνήθως μετά από 8-10 χρόνια από την πρώτη αρθροπλαστική και τότε απαιτείται αναθεώρηση της αρθροπλαστικής, επέμβαση επώδυνη για άτομα μεγάλης ηλικίας που είναι η πλειονότητα αυτών που έχουν υποβληθεί σε αρθροπλαστική. Είναι λοιπόν σήμερα ζητούμενο η καθυστέρηση της χαλάρωσης και η παράταση της ζωής των προθέσεων με κάποια φαρμακευτική αγωγή. Οι πρωτεϊνικές και οι ΜΑΡ κινάσες θεωρούνται κομβικά ένζυμα στη κυτταρική σηματοδότηση και στην ενεργοποίηση ποικίλων μεταγραφικών παραγόντων, και εμπλέκονται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Αναστολείς των ενζύμων αυτών βρίσκονται σήμερα σε διάφορες κλινικές δοκιμές. Για την προσέγγιση του ερωτήματος κατά πόσο αναστολείς των πρωτεϊνικών και ΜΑΡ κινασών θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην επιμήκηνση του χρόνου ζωής των προθέσεων αρθροπλαστικής, περιπροσθετικοί ιστοί καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία αναστολέων των ενζύμων αυτών και στο μέσο καλλιέργειας προσδιορίσθηκαν τα επίπεδα παραγόντων με σημαντικό ρόλο στη χαλάρωση των προθέσεων, όπως μεταλλοπρωτεασών και των αναστολέων τους (sΜΤ1-ΜΜΡ, MMP-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, MMP-13 & TIMP-1), IL-6 και PGE2. Χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι όπως, ανοσοαποτύπωση western, ELISA, και ζυμογράφημα ζελατίνης. Τα πειράματα έδειξαν ότι σε γενικές γραμμές οι αναστολείς προκάλεσαν κυρίως μείωση ή δεν επηρέασαν την παραγωγή των παραγόντων που μελετήθηκαν σε κάποιες όμως περιπτώσεις προκάλεσαν και αύξηση της παραγωγής τους. Για τη διατύπωση όμως ασφαλών συμπερασμάτων σχετικά με το κατά πόσο τέτοιοι αναστολείς θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην επιμήκυνση του χρόνου ζωής των προθέσεων, απαιτούνται περαιτέρω πειράματα με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών.