Characterisation of a second actin gene: analysing its function in the plasmodium berghei mosquito midgut stages

Abstract

The causative agent for the debilitating disease malaria is the Plasmodium parasite. Plasmodium spp is the only genus of Apicomplexa which possesses an additional gene encoding actin besides the major actin isoform actin I. This second actin has been termed actin II. It has been found to be expressed in male gametocytes and ookinetes in the murine model strain P. berghei. Disruption resulted in an impairment of the male gametocyte to exflagellate and a 50-fold decrease in ookinete formation, while females remained fertile. In this study we explored the role of actin II in the mosquito stages. By performing genetic crosses with a knockout strain of actin II (actll(-)) and the wild type (wt) we determined that heterozygous oocysts were formed, but did not develop further than ~ three days, while the homozygous wt ookinetes developed into mature oocysts. To analyse this defect further, we attempted to alter expression levels of actin II by exchanging its promoter region with promoter regions from proteins known to be expressed in the male gametocyte. Two mutant strains, cdpk4p-actll and setp-actin II were constructed. While the cdpk4-actll parasites did not show any detectable phenotype, the setp-actll mutant displayed a growth defect in the asexual stages, even though its driving promoter is exclusively active in the sexual stages. We also studied a pure heterozygous ookinete population with a parasite strain producing only males and the actll(-) female and observed that actin II was not expressed in these ookinetes. The resulting oocysts were growth arrested and did not undergo DNA replication. We followed the expression of GFP tagged actin II and showed that the highest protein expression occurs within the first few hours of zygote formation. These results show that actin II is a sex-specific protein required in the male gametogenesis however it is inherited from the female gamete during zygote formation to complete the transmission cycle through the mosquito.

Ο μολυσματικός παράγοντας της ελονοσίας είναι το παράσιτο που ανήκει στο γένος του πλασμωδίου. Στο φύλο των Apicomplexa το πλασμώδιο είναι το μόνο που έχει ένα επιπλέον γονίδιο που κωδικοποιεί για ένα επιπλέον γονίδιο ακτίνης πέρα της ακτίνης Ι. Η δεύτερη ακτίνη ονομάζεται Ακτίνη II και εκφράζεται στα αρσενικά γαμετοκύτταρα και ωοκινέτες στο παράσιτο Plasmodium berghei των τρωκτικών. Η έλλειψη του γονιδίου είχε ως αποτέλεσμα την ανικανότητα των αρσενικών γαμετοκυττάρων να παράγουνε ενεργά μαστίγια και 50 φορές μειωμένο αριθμό ωοκινετών, ενώ καμιά αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα θηλυκά γαμετοκύτταρα. Στη μελέτη αυτή διερευνάται ο ρόλος της Ακτίνης II κατά την ανάπτυξη του παρασίτου στο κουνούπι. Πραγματοποιήσαμε γενετικές διασταυρώσεις μεταξύ ενός παρασιτικού στελέχους στο οποίο λείπει το γονίδιο της ακτίνης II (actinll(-)) και του άγριου τύπου (wt) και δείξαμε ότι δημιουργούνται ετερόζυγες ωοκίστες που δεν αναπτύσσονται πέρα από τις 3 ημέρες σε αντίθεση με τις ομόζυγες ωοκίστες. Για να μελετήσουμε αυτό το φαινότυπο, δοκιμάσαμε να αλλάξουμε τα επίπεδα έκφρασης της ακτίνης II με αντικατάσταση του υποκινητή από υποκινητές γονιδίων που είναι γνωστά ότι εκφράζονται στο αρσενικό γαμετοκύτταρο. Δύο μεταλλαγμένα στελέχη παράχθηκαν το cdpk4-octinll και setp-actinll. Τα cdpk4-actinll στελέχη δεν παρουσίασαν διαφορετικό φαινότυπο σε σχέση με τον άγριο τύπο ενώ τα setp-actinll στελέχη παρουσίασαν πολύ αργό ρυθμό ανάπτυξης στα μη σεξουαλικά στάδια παρόλο που ο υποκινητής αυτός εκφράζεται αποκλειστικά στα σεξουαλικά στάδια. Μελετήθηκε επίσης ένας ετερόζυγος πληθυσμός οοκινετών που δημιουργήθηκε μεταξύ ενός παρασιτικού στελέχους που παράγει μόνο ενεργά αρσενικά γαμετοκύτταρα με το θηλυκά γαμετοκύτταρα του στελέχους όπου λείπει το γονίδιο της ακτίνης II. Οι ωοκίστες που παράχθηκαν με αυτή τη διασταύρωση δεν περιείχαν γονιδιακό DNA. Χρησιμοποιώντας ένα στέλεχος όπου η ακτίνη II είναι συζευγμένη με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) δείξαμε ότι η μεγαλύτερη πρωτεϊνική έκφραση πραγματοποιείται τις πρώτες ώρες μετά το σχηματισμό του ζυγωτού. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουνε ότι η ακτίνη II απαιτείται στα σεξουαλικά στάδια της ζωής του παρασίτου στη γαμετογέννεση του αρσενικού γαμετοκυττάρου ενώ κληροδοτείται στο ζυγωτό μέσω του θηλυκού γαμέτη έτσι ώστε να μπορέσει να ολοκληρωθεί ο κύκλος ζωής του παρασίτου μέσα στο κουνούπι.