Ανοσοϊστοχημική μελέτη της κατανομής του κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ στον διάρθριο δίσκο αυξανόμενων κουνελιών μετά από πρόσθια μετατόπιση της κάτω γνάθου

Abstract

Although it is generally accepted that functional appliances, either the Herbst or the Activator type, are effective in the orthodontic treatment of Class II malocclusion of growing patients, their action at the molecular level is still ignored. Despite that a lot of studies are looking for the answer to this query through molecular biology, the effect of functional appliances on the cells of the temporomandibular joint and the way these cells interact with the substances of the surrounding matrix is still unknown. Almost all current animal research in this field has focused on the effects of different types of appliances on the cells and the basic macromolecules of the condyle and glenoid fossa and has ignored the temporomandibular joint disc. Most of this research has also been conducted with rats despite that their masticatory apparatus does not resemble that of man, as much as the masticatory apparatus of the rabbit. The rabbit’s ability to protrude and laterally slide the mandible, the direction and the magnitude of forces which are applied on the condyles and the ossified mandibular symfysis, are characteristics with a closer similarity to the human masticatory system than that of mice. Collagen type I is the main type of collagen in the extracellular matrix of the temporomandibular disc. It’s physical and mechanical properties and architecture in the matrix, fundamentally determine the disc’s mechanical status. On the other hand, the role of type III collagen, has not been clearly clarified. Type III collagen aggregates on the extracellular collagen network of physiological and osteoarthritic cartilage, but it is uncertain if it marks the cartilage healing process or the remodeling process. It is also unknown if the presence of collagen type III on the articular cartilage, under experimental conditions, indicates pathological or physiological processes. On the other hand it is proved, that under physiological conditions, collagen type III aggregates with collagen type I by covalent bonds and defines the size of collagen type I fibrils and mechanical properties. As a conclusion, one could support that collagen type III has a key role in every transformation of the extracellular matrix either of pathological or physiological nature.The purpose of this study was to investigate the expression of collagen type I and III in the matrix of the articular disc of growing rabbits, after mandibular protrusion. Twelve male New Zealand rabbits, 6 weeks old were used, in eight of which mandibular protrusion was conducted for 12 hours per day for a period of 14 days. Four rabbits were used as the control group. In the experimental group animals, protrusion was attained through two ligature wires fastened around their upper and lower incisors, which had been properly drilled at their distal surfaces. A third ligature wire was fastened between the previous two, leading upper and lower incisors into crossbite. After this period all animals were deeply anaesthetized and killed by cardiac perfusion, with 10% buffered formalin using an infusion pump. Their discs were dissected and fixed in test tubes filled with 10% buffered formalin for 24 hours. Disks were transferred then to the histocineta device for dehydration and final fixation. After 18 hours all discs were embedded in paraffin with proper orientation. Paraffin sections of a 6μm thickness with an anteroposterior direction were made, mounted on slides and stored. Sections were prepared and immunohistochemically stained with the use of monoclonal antibodies against collagen type I and III. All specimens were photographed with a Sony CCD-IRIS digital camera connected to a Zeiss microscope, model Axiolab 10x/25. More than twenty photos from each specimen were downloaded, chromatically uniformed and montaged with the Image Pro-plus 3.0 (Media Cybernetics, Silver Springs, MD, USA) program. Each specimen was divided into five regions (frontal, mediofrontal, medial, medioposterior and posterior) and five layers (upper,upper-mesial, mesial, lower-mesial and lower). The optical density of the antibodies’ signal was calculated, with the aid of the same program, at the five layers and at the five regions for each specimen. Statistical analysis of the antibodies’ signal was done using the SPSS 16 statistical program and the Linear Mixed Models analysis.Collagen type I expression was not found to have any statistically significant difference between the left and right condyles (sig. 0.982). Although the experimental group was found to have 8.72 more units of Collagen type I antibody signal from the control group, this difference was not statistically significant (sig.0564). No statistically significant difference was found between the layers and the regions of the control and the experimental group for Collagen type I.Collagen type III expression was also found to have no statistically significant difference between the left and right condyles ( sig. 0.579). On the contrary, the expression of collagen type III was found to be reduced on the experimental group at a statistically significant level (p<.05). Collagen type III was also found to be less expressed in the central layer of the disc at a statistically significant level (p<0.001) when compared with the outer layers. No statistically significant difference was found between the regions of the control and the experimental group.This recearch’s findings probably detect processes involved in the beginning of articular disc remodeling after mandibular protrusion. These processes seem to start from the inner layers of the disc by the reduction of the amount of type III Collagen, which is considered to play a key role in the remodeling of the extracellular matrix. However it is unclear from the present study if these processes are of pathological or physiological nature.

Η αποτελεσματικότητα των λειτουργικών μηχανημάτων προώθησης της κάτω γνάθου, τόσο των σταθερών τύπου Herbst όσο και των κινητών τύπου Activator, είναι πλέον αποδεκτή από το σύνολο των ειδικών. Παρόλα αυτά ο ακριβής τρόπος δράσης τους σε κυτταρικό επίπεδο παραμένει άγνωστος. Εξακολουθούμε δηλαδή να αγνοούμε την επίδραση των λειτουργικών μηχανημάτων στα κύτταρα της περιοχής της κροταφογναθικής, καθώς επίσης και πώς αυτά με την σειρά τους καθορίζουν την μεταβολή της θεμέλιας ουσίας που τα περιβάλλει. Η απάντηση στα ερωτήματα αυτά αναζητείται πλέον μέσα από την μελέτη της λειτουργίας των κυττάρων σε μοριακό επίπεδο, καθώς και της φαινοτυπικής τους έκφρασης, η οποία φανερώνεται κυρίως μέσω των μεταβολών της σύστασης της θεμέλιας ουσίας. Σε αυτό το πλαίσιο οι περισσότερες εργασίες που ασχολούνται με την αναδιαμόρφωση-αύξηση στην περιοχή της ΚΓΔ έχουν επικεντρωθεί στην περιοχή του κονδύλου της κάτω γνάθου, καθώς και στην περιοχή της κροταφικής γλήνης. Αντίθετα, ο διάρθριος δίσκος έχει μελετηθεί ελάχιστα και μόνο περιγραφικά σε σχέση με τα βασικά μακρομόρια που τον απαρτίζουν (κολλαγόνο και γλυκοζαμινογλυκάνες).Στην παρούσα εργασία είχαμε ως στόχο την μελέτη της πιθανής μεταβολής της θεμέλιας ουσίας του διάρθριου δίσκου αναπτυσσομένων κουνελιών μετά από πρόσθια μετατόπιση της κάτω γνάθου για 12 ώρες την ημέρα, μέσω του ποσοτικού προσδιορισμού των κολλαγόνων τύπου Ι και ΙΙΙ.Τα κουνέλια επιλέχτηκαν ως πειραματόζωα στην παρούσα μελέτη καθώς τα ανατομικά και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά του στοματογναθικού συστήματός τους, προσομοιάζει καλύτερα τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά της ΚΓΔ του ανθρώπου, σε σχέση με άλλα ζώα. Η δυνατότητα και το εύρος των κινήσεων προολίσθησης και πλαγιολίσθησης της κάτω γνάθου, το είδος των δυνάμεων που ασκούνται στην περιοχή των κονδύλων, καθώς και η κλειστή γενειακή σύμφυση, τα καθιστούν καταλληλότερα πειραματόζωα σε σχέση με τους επίμυες και τα άλλα τρωκτικά για την μελέτη της ΚΓΔ. Το χαμηλό κόστος κτήσης, το μικρό τους μέγεθος, καθώς και ο εύκολος χειρισμός τα καθιστούν πιο προσιτά για καθαρά πρακτικούς λόγους, σε σχέση με τα άλλα παμφάγα ζώα όπως οι πίθηκοι και τα γουρούνια, των οποίων η ΚΓΔ είναι ακόμη περισσότερο όμοια με του ανθρώπου.Το κολλαγόνο τύπου Ι αποτελεί τον βασικό τύπο κολλαγόνου στην θεμέλια ουσία του διάρθιου δίσκου. Οι φυσικές και μηχανικές ιδιότητες του δίσκου φαίνεται να καθορίζονται σε μεγάλο βαθμό από τις αντίστοιχες ιδιότητες του κολλαγόνου Ι αλλλά και από την διάταξη και την αρχιτεκτονική της κατανομής του μέσα στο δίσκο. Αντίθετα ο ρόλος του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ δεν είναι πλήρως διασαφηνισμένος. Το κολλαγόνο τύπου III φαίνεται ότι προσκολλάται ομοιοπολικά στην πολυμερή κατασκευή του αρθρικού χόνδρου των ενηλίκων, πιθανόν ως αποτέλεσμα της επουλωτικής διαδικασίας ή της αναδιαμόρφωσης του χονδρικού ιστού. Αυτό συμβαίνει τόσο σε φυσιολογικές αρθρώσεις όσο και σε πάσχουσες από οστεοαρθρίτιδα, αλλά δεν είναι γνωστό αν σηματοδοτεί παθολογικά γεγονότα ή φυσιολογικό μηχανισμό επούλωσης. Είναι επίσης αποδεκτό, πως η προσθήκη του κολλαγόνου ΙΙΙ στην πολυμερή κατασκευή του δικτύου των κολλαγόνων της θεμέλιας ουσίας, καθορίζει το τελικό μέγεθος των ινιδίων του κολλαγόνου τύπου Ι. Θεωρείται πολύ πιθανόν, η παρουσία του κολλαγόνου τύπου III στην πολυμερή θεμέλια ουσία του αρθρικού χόνδρου να υποδεικνύει ενεργό διαδικασία αναδιαμόρφωσης. Στην μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν 12 αρσενικά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας ηλικίας 6 εβδομάδων. Τα 4 από αυτά χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες ενώ τα υπόλοιπα 8 υποβλήθηκαν σε προολίσθηση της κάτω γνάθου για 12 ώρες την ημέρα. Η προολίσθηση επιτεύχθηκε με την βοήθεια δύο συρμάτινων προσδέσεων οι οποίες περιδέθηκαν γύρω από τους άνω και κάτω κεντρικούς τομείς και μίας τρίτης πρόσδεσης που περιδέθηκε γύρω από τις άλλες δύο και σταθεροποίησε την κάτω γνάθο σε θέση προολίσθησης. Μετά από 14 ημέρες τα ζώα θυσιάστηκαν με την βοήθεια αντλίας έγχυσης και διαλύματος φορμόλης 10%, προκειμένου να επιτευχθεί το κατάλληλο επίπεδο μονιμοποίησης των ιστών, ώστε να είναι δυνατή η εφαρμογή ανοσοϊστοχημικής χρώσης. Στην συνέχεια παρασκευάστηκαν και αφαιρέθηκαν οι διάρθριοι δίσκοι και τοποθετήθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες με διάλυμα φορμόλης 10% για 24 ώρες. Ακολούθησε περαιτέρω μονιμοποίηση και αφυδάτωση με την βοήθεια συσκευής ιστοκινέτας στην οποία και παρέμειναν για 18 ώρες. Κατόπιν οι δίσκοι εγκυβωτίστηκαν σε παραφίνη με κατάλληλο προσανατολισμό και κατόπιν πραγματοποιήθηκαν, με την βοήθεια μικροτόμου, τομές πάχους 6μ με προσθιοπίσθια κατεύθυνση. Ακολούθησε ανοσοϊστοχημική χρώση με την χρήση του βασικού πακέτου αντιδραστηρίων Max Tag Histo Kit της εταιρείας Rockland Inc., Gilbertsville, Philadelphia, U.S.A. και κατάλληλα μονοκλωνικά αντισώματα που παρασκευάζονται από την εταιρεία Medicorp Inc.,Montreal, Canada, με κωδικό προϊόντων AF-5810 και AF-5610 έναντι των κολλαγόνων τύπου Ι και ΙΙΙ αντιστοίχως. Την ανοσοϊστοχημική χρώση ακολούθησε η μέτρηση της οπτικής πυκνότητας. Με την βοήθεια ψηφιακής κάμερας τύπου Sony CCD-IRIS, η οποία ήταν συνδεδεμένη με μικροσκόπιο τύπου Zeiss (μοντέλο Axiolab 10x/25), και με την χρήση του προγράμματος Image Pro-plus (έκδοση 3.0 της εταιρείας Media Cybernetics, Silver Springs, MD, USA) έγινε λήψη 20-30 εικόνων από κάθε χρωσμένη τομή. Με την βοήθεια του ηλεκτρονικού υπολογιστή ακολούθησε σύνθεση των εικόνων κάθε τομής ώστε να σχηματιστεί η ενιαία εικόνα κάθε τομής και η ομογενοποίηση της χρωματικής απόχρωσης των εικόνων. Κάθε πλήρης εικόνα της τομής κάθε δίσκου διαιρέθηκε σε πέντε τμήματα ή περιοχές (1-πρόσθια, 2-πρόσθια-μέση, 3-μέση, 4-οπίσθια-μέση και 5-οπίσθια). Ο διαχωρισμός αυτός έγινε στα σημεία όπου το περίγραμμα του δίσκου μεταπίπτει από κυρτό σε κοίλο. Ακολούθως κάθε περιοχή χωρίστηκε σε πέντε στιβάδες με βάση την μορφολογία των κυττάρων (1-ανώτερη, 2-άνω ενδιάμεση, 3-μέση, 4-κάτω ενδιάμεση και 5-κατώτερη). Σε κάθε μία από τις στοιβάδες κάθε περιοχής, έγιναν μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας του σήματος του πρωτογενούς αντισώματος, μέσω του ηλεκτρονικού υπολογιστή και την βοήθεια του ανωτέρω προγράμματος.Για τη στατιστική ανάλυση του ποσοτικοποιημένου σήματος της ανοσοϊστοχημείας, χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS 16. Ο έλεγχος της στατιστικής σημαντικότητας των διαφορών μεταξύ της ομάδας των μαρτύρων και της ομάδας του δείγματος, καθώς και η εκτίμηση των μέσων διαφορών και των υπολοίπων παραγόντων (δίσκος, περιοχή, στιβάδα), πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της μεθόδου Linear Mixed Models.Για το κολλαγόνο τύπου Ι, η σύγκριση της οπτικής πυκνότητας μεταξύ αριστερών και δεξιών δίσκων δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά (sig. 0,982). Ομοίως τα επίπεδα οπτικής πυκνότητας του κολλαγόνου Ι αν και φαίνεται να είναι υψηλότερα στην ομάδα των πειραματοζώων κατά 8.72 μονάδες κατά μέσο όρο, η διαφορά αυτή δεν είναι στατιστικά σημαντική (sig. 0.564). Επίσης, δεν εντοπίζονται στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις περιοχές και τις στοιβάδες.Η διαφορά της οπτικής πυκνότητας του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ μεταξύ αριστερών και δεξιών δίσκων δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική διαφορά (sig. 0,579). Αντίθετα τα επίπεδα οπτικής πυκνότητας του κολλαγόνου ΙΙΙ φαίνεται να είναι υψηλότερα στην ομάδα των πειραματοζώων κατά 26.78 μονάδες κατά μέσο όρο, διαφορά που είναι στατιστικά σημαντική (sig. 0.013) σε επίπεδο σημαντικότητας 5%. Αντίθετα δεν εντοπίστηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των περιοχών. Όσον αφορά στις στοιβάδες, τα επίπεδα οπτικής πυκνότητας του κολλαγόνου ΙΙΙ φαίνεται να μειώνονται προοδευτικά στις στοιβάδες 2,1 και 4,5 συγκριτικά με τη στοιβάδα 3. Επί πλέον, οι διαφορές των 14.21 και 18.33 μονάδων μεταξύ των στοιβάδων 1 και 5 σε σχέση με τη στοιβάδα 3, αντίστοιχα, είναι στατιστικά σημαντικές (sig. <0.001). Κατά συνέπεια, η ποσότητα του κολλαγόνου ΙΙΙ είναι μειωμένη σε βαθμό στατιστικά σημαντικό στους δίσκους των πειραματοζώων και η μείωση αυτή είναι εντονότερη στην στοιβάδα 3, δηλαδή στη μέση στιβάδα του δίσκου και χαμηλότερη στις στοιβάδες 1,2 και 4,5 σε στατιστικά σημαντικό βαθμό.Συμπερασματικά, τα ευρήματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν πιθανόν την έναρξη των κυτταρικών διαδικασιών αναδιαμόρφωσης του δίσκου, μετά από πρόσθια μετατόπιση της κάτω γνάθου, χωρίς να είναι σαφές αν πρόκειται για φυσιολογική ή παθολογική διαδικασία. Η μεταβολή της σύστασης της θεμέλιας ουσίας φαίνεται να ξεκινά από την κεντρική στιβάδα του δίσκου με την μείωση της παρουσίας του κολλαγόνου ΙΙΙ.