Σχεδιασμός και σύνθεση αναστολέων μεταλλοενζύμων

Abstract

Phosphinic pseudopeptides constitute an important class of peptidic analogues with potent inhibitory activity against of zinc metalloproteases. Acting as transition state analogues, phosphinic pseudopeptides have proved to be potent and selective inhibitors of a many-member family of zinc metalloproteases, namely matrixins (MMPs), whose functions are implicated in both physiological and pathological conditions like embryonic development, tissue remodeling, hypertension, metastasis of cancer cells, arthritis etc. Activity based protein profiling (ABPP), a technique that has been adapted for the study of metalloproteases including MMPs and their role in pathological processes, uses small-molecule activity based probes that covalently modify active site residues through a highly specific chemical reaction that depends on enzyme activity. The present study consists of the following: The synthesis of phosphinic pseudotetrapeptides bearing the group of aryltrifluromethyldiazirine at the end of P1΄ position. This group releases a reactive carbene upon photolysis able to generate a covalent and irreversible linkage with the residues of the active site of the target enzymes. The incorporation of the photoreactive group at the structure of phosphinic inhibitors was accomplished either via a 1,3-dipolar cycloaddition of a suitable nitrile oxide or via Sonogashira reaction of a substituted aryl iodide with a phosphinic derivative bearing a terminal triple bond at P1΄ position. The synthesis of phosphinic and non-phosphinic peptides bearing an electrophilic center at the end of P1΄ position able to form covalent bond with the ε-NH2 of Lys241 side chain of hMMP-12, which according to the literature have been covalently modified by a photoaffinity probe. These electrophilic centers derived by a common styrene precursor at the final synthetic step. The synthesis of phosphinic pseudotetrapeptide bearing substituted isoxazole rings into the P1΄ position in order to study the S1΄ subsite of MMP-8, -9 and -14. Phosphinic building blocks were synthesized via P-Michael addition of phenyl-phosphinic acid to isoxazole substituted acrylates and then were incorporated in peptidic sequence via synthesis in solid phase. The phosphinic analog, bearing the para-ethoxy phenyl substituted isoxazole ring, display potent inhibition toward MMP-9 with Ki = 9 pM. The synthesis and the evaluation of inhibitory potency of «exploding transition state analogues» that were produced by the insertion of a methylene spacer between the phosphorus and nitrogen atoms at the structure of phosphonamidates. The key step of the synthesis of α,α΄-diaminophosphinic derivatives was the three-component condensation reaction of Fmoc-carbamate, formalin and Cbzprotected aminophosphinic analogue of phenylalanine in AcCl. Removal of Fmoc-group and Nalkylation of the free amine with secondary bromides afforded the α,α΄-diaminophosphinic dipeptides. The α,α΄-diaminophosphinic pseudotripeptides are less potent inhibitors of matrixins compared with the corresponding phosphinic pseudotripeptides. The development of a methodology for the synthesis of α- and β-hydroxy phosphinic building blocks. The key step for the synthesis of the α-hydroxy phosphinic derivative was the reaction of Hphosphinate with a substituted 2-formyl-ester. The synthesis of β-hydroxy phosphinic derivatives was accoplished via ring opening reaction of epoxide by silylated H-phosphinate. α- and β-hydroxy phosphinic pseudotripeptides were synthesized in order to evaluate the influence of the introduction of the hydroxy group at these positions to the inhibitory potency toward matrixins. Biological evaluation of these compounds against matrixins is under way. The synthesis of phosphinic pseudopeptidic sequences that mimic the peptidic sequence of α2 chain of collagen (I), that the scissible bond has been replaced by the phosphinic transition state analogue GlyΨ{P(O)(OH)CH2}Leu, in order to evaluate their inhibitory activity against collagenases. A phosphinic building block FmocGlyΨ{P(O)(OAd)-CH2}Leu was synthesized via an amidoalkylation reaction of monoalkylated phosphinic acid, formalin and Fmoc-carbamate. The next step was the incorporation of the phosphinic building block in various peptidic sequences via synthesis in solid phase using Μultipin technology. The phosphinic pseudopeptides behave as potent inhibitors of MMP-8. The phosphinic peptide with the repeated triplet GlyProHyp at the N-terminus proved to be very potent inhibitor of MMP-8.

Τα φωσφινικά ψευδοπεπτίδια αποτελούν μια σημαντική τάξη πεπτιδικών αναλόγων με ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι των μεταλλοπρωτεασών ψευδαργύρου. Δρώντας ως ανάλογα μεταβατικής κατάστασης, τα φωσφινικά ψευδοπεπτίδια έχουν αποδειχτεί ισχυροί και εκλεκτικοί αναστολείς μιας πολυπληθούς οικογένειας μεταλλοπρωτεασών ψευδαργύρου, των ματριξινών (MMPs), η δράση των οποίων σχετίζεται με πολλές φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις όπως την εμβρυϊκή ανάπτυξη, την ανακατασκευή των οστών, την υπέρταση, τη μετάσταση καρκινικών κυττάρων, την αρθρίτιδα κ.α. Η ταυτοποίηση πρωτεϊνών βασιζόμενων σε δραστικότητα (Activity based protein profiling-ABPP), μια τεχνική που έχει υιοθετηθεί για τη μελέτη των μεταλλοπρωτεασών, περιλαμβανομένων και των MMPs, και του ρόλου τους σε παθολογικές καταστάσεις, χρησιμοποιεί μικρά μόρια ως ανιχνευτές βασιζόμενοι σε δραστικότητα που συνδέονται ομοιοπολικά με αμινοξέα του ενεργού κέντρου μέσω εξειδικευμένης χημικής αντίδρασης, που βασίζεται στη δράση του ενζύμου. H παρούσα εργασία έχει ως αντικείμενο: Τη σύνθεση φωσφινικών ψευδοτετραπεπτιδίων στο άκρο της P1΄ θέσης των οποίων έχει ενσωματωθεί η ομάδα 3-τριφθορομεθυλο-3-φαινυλοδιαζιρίνη. Κατά τη φωτόλυση της ομάδας αυτής παράγεται δραστικό καρβένιο ικανό να σχηματίσει ομοιοπολικό δεσμό και μη αντιστρεπτό δεσμό με αμινοξέα του ενεργού κέντρου των ενζύμων-στόχων. Η εισαγωγή της φωτοενεργής ομάδας στη δομή φωσφινικών αναστολέων πραγματοποιήθηκε είτε μέσω αντίδρασης 1,3-διπολικής κυκλοπροσθήκης του κατάλληλα υποκατεστημένου οξειδίου του νιτριλίου είτε μέσω αντίδρασης Sonogashira υποκατεστημένου ιωδοβενζολίου με το ακραίο τριπλό δεσμό της P1' θέσης φωσφινικού παραγώγου. Τη σύνθεση φωσφινικών και μη-φωσφινικών πεπτιδίων που φέρουν στο άκρο της P1' θέσης ηλεκτρονιόφιλα κέντρα ικανά να πραγματοποιήσουν ομοιοπολική πρόσδεση με την ε-ΝΗ2 της πλευρικής αλυσίδας της Lys241 της hMMP-12, που σύμφωνα με τη βιβλιογραφία έχει υποστεί ομοιοπολική τροποποίηση από ένα ανιχνευτή φωτοσυγγένειας. Τα ηλεκτρονιόφιλα αυτά κέντρα προέκυψαν μέσω αντίδρασης ενός πρόδρομου-μορίου που φέρει την ομάδα του στυρενίου στο τελικό στάδιο της σύνθεσης. Τη σύνθεση φωσφινικών ψευδοτετραπεπτιδίων που φέρουν στην P1' θέση υποκατεστημένους ισοξαζολικούς δακτυλίους προκειμένου να διερευνηθεί η S1' υποπεριοχή των MMP-8, -9 και -14. Συντέθηκαν οι βασικές φωσφινικές μονάδες μέσω αντίδρασης P-Michael του φαινυλοφωσφινικού οξέος με τους υποκατεστημένους ισοξαζολικούς ακρυλικούς εστέρες και στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε πεπτιδική αλληλουχία σε στερεά φάση. Το φωσφινικό ανάλογο, που φέρει τον π- αιθοξυφαινυλο-υποκατεστημένο ισοξαζολικό δακτύλιο, έδειξε ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι της ΜΜP-9 με Κi = 9 pM. Η σύνθεση και η μελέτη της ανασταλτικής δράσης «αναλόγων προχωρημένης μεταβατικής κατάστασης» που προκύπτουν από την εισαγωγή μιας μεθυλενικής ομάδας-συνδέσμου (spacer) ανάμεσα στα άτομα φωσφόρου και αζώτου στη δομή των φωσφοναμιδικών πεπτιδίων. Στάδιο-κλειδί για τη σύνθεση των α,α΄-διαμινοφωσφινικών παραγώγων ήταν η αντίδραση συμπύκνωσης τριών συστατικών, του Fmoc-καρβαμιδικό εστέρα, της φορμαλίνης και Cbz-προστατευμένου αμινοφωσφινικού αναλόγου της φαινυλαλανίνης σε AcCl. Απομάκρυνση της Fmoc-ομάδας και Ν- αλκυλίωση της απελευθερούμενης αμινομάδας με δευτεροταγή βρωμίδια οδήγησαν στα α,α΄-διαμινοφωσφινικά διπεπτίδια. Τα α,α΄-διαμινοφωσφινικά ψευδοτριπεπτίδια αποδείχτηκαν ασθενέστεροι αναστολείς έναντι των ματριξινών εν συγκρίσει με τα αντίστοιχα φωσφινικά ψευδοτριπεπτίδια. Την ανάπτυξη μιας μεθόδου για τη σύνθεση α- και β-υδροξυ-φωσφινικών δομικών μονάδων. Στάδιο κλειδί για τη σύνθεση του α-υδροξυ-φωσφινικού παραγώγου ήταν η αντίδραση του Η- φωσφινικού εστέρα με ένα υποκατεστημένο 2-φορμυλο-εστέρα. Η σύνθεση των β-υδροξυ- φωσφινικών παραγώγων πραγματοποιήθηκε μέσω αντίδρασης διάνοιξης του δακτυλίου των εποξειδίων από τον σιλυλιωμένο Η-φωσφινικό εστέρα. Συντέθηκαν α- και β- φωσφινικά ψευδοτριπεπτίδια προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της εισαγωγής της υδροξυλομάδας σε αυτές τις θέσεις στην ανασταλτική δράση έναντι των ματριξινών. Τη σύνθεση φωσφινικών ψευδοπεπτιδικών αλληλουχιών που μιμούνται τη πεπτιδική αλληλουχία της α2 αλυσίδας του κολλαγόνου του τύπου Ι, όπου ο υδρολυόμενος δεσμός έχει αντικατασταθεί από το φωσφινικό ανάλογο μεταβατικής κατάστασης GlyΨ{P(O)(OH)CH2}Leu, προκειμένου να μελετηθούν οι ανασταλτικές τους δράσεις έναντι των κολλαγoνασών. Παρασκευάστηκε μια βασική φωσφινική μονάδα FmocGlyΨ{P(O)(OAd)-CH2}Leu μέσω αντίδρασης αμιδοαλκυλίωσης του μονο- αλκυλιωμένου φωσφινικού οξέος, του Fmoc-καρβαμιδικού εστέρα και υδατικής φορμαλδεΰδης. Ακολούθησε ενσωμάτωση της φωσφινικής μονάδας σε ποικίλες πεπτιδικές αλληλουχίες σε σύνθεση σε στερεά φάση εφαρμόζοντας Μultipin τεχνολογία. Τα φωσφινικά ψευδοπεπτίδια αποδείχτηκαν ισχυροί αναστολείς της MMP-8. Το φωσφινικό πεπτίδιο με την επαναλαμβανόμενη τριπλέτα GlyProHyp στο Ν-τελικό άκρο αποδείχτηκε ιδιαίτερα ισχυρός αναστολέας της MMP-8.