Μελέτη του μεταγραφικού παράγοντα Nrf2 ως διαμεσολαβητή της δράσης των στατινών

Abstract

The beneficial effects of HMG-CoA (3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA) reductase inhibitors (statins) have been attributed not only to their cholesterol lowering effect but also to their pleiotropic actions and especially to their anti-oxidant activity. Nrf2 (NF-E2-related factor 2) is a transcription factor that orchestrates the transcriptional response of cells to oxidative stressors and electrophilic xenobiotics. In the present study, Wistar rats, primary hepatocytes, ST-2 cells and primary mouse embryonic fibroblasts from wild type or Nrf2 knock out C57BL6J mice were used to explore the potential role of Nrf2 in mediating the antioxidant effects of statins. Simvastatin triggered nuclear translocation of Nrf2 in rat liver and in primary rat hepatocytes in a mevalonate-dependent and cholesterol-independent way. In liver nuclear extracts from simvastatin-treated rats, the DNA-binding activity of Nrf2 was significantly increased and the mRNA of two known targets of Nrf2, HO-1 (Heme Oxygenase 1) and GPX-2 (Glutathione Peroxidase 2) was induced. In ST-2 cells (ARE-ST2) stably transfected with constructs bearing Nrf2-binding site (antioxidant responsive element), simvastatin enhanced Nrf2-mediated transcriptional activity in a mevalonate-dependent and cholesterol-independent fashion. Moreover, in WT and KO-Nrf2 primary mouse embryonic fibroblasts, after incubation with simvastatin, the addition of glucose-oxidase resulted in much greater levels of ROS (Reactive Oxygen Species) in simvastatin treated KO-Nrf2 fibroblasts compared to their WT counterparts, which means that simvastatin eliminates ROS in a Nrf2 dependent way. Finally, the use of PI3K/Akt pathway inhibitors in simvastatin treated ARE-ST2 cells leads to the attenuation of the simvastatin-induced enhanced Nrf2 transcriptional activity. In the present study, it is shown for the first time that a) simvastatin activates the Keap1/Nrf2 signaling pathway in in vivo and in vitro models in a mevalonate- dependent, cholesterol-independent fashion and b) that simvastatin lowers reactive oxygen species level by Nrf2 activation via PI3K/Akt pathway. The activation of Nrf2 by simvastatin besides providing effective protection of the cell from the deleterious effects of oxidative stress, it explains in part the pleiotropic actions of statins.

Τα ευεργετικά αποτελέσματα των αναστολέων της αναγωγάσης του HMG-CoA (3-υδροξυ-3-μεθυλ-γλουταρυλ-συνένζυμο Α) έχουν αποδοθεί όχι μόνο στη μείωση των επιπέδων χοληστερόλης αλλά και στις πλειοτροπικές τους δράσεις και ιδιαίτερα στις αντιοξειδωτικές τους δράσεις. Ο Nrf2 (NF-E2-related factor 2) είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που ενορχηστρώνει τη μεταγραφική απάντηση των κυττάρων στο οξειδωτικό στρες και σε ηλεκτροφιλικά ξενοβιοτικά με την έκφραση αντιοξειδωτικών-κυτταροπροστατευτικών γονιδίων. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν επίμυες Wistar, πρωτογενείς καλλιέργειες ηπατοκυττάρων, ST-2 κύτταρα και πρωτογενείς εμβρυϊκοί ινοβλάστες από μυς C57BL6J αγρίου τύπου (WT) ή με απαλοιφή του Nrf2 (KO-Nrf2) για τη μελέτη του ρόλου του Nrf2 στη διαμεσολάβηση των αντιοξειδωτικών δράσεων των στατινών. Η σιμβαστατίνη ενεργοποίησε τον Nrf2, δηλαδή οδήγησε στη μετακίνησή του στον πυρήνα στο ήπαρ επίμυων και σε πρωτογενή καλλιέργεια ηπατοκυττάρων. Η ανωτέρω δράση ήταν εξαρτώμενη από το μεβαλονικό και ανεξάρτητη από τη χοληστερόλη. Σε πυρηνικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από ήπαρ επίμυων που έλαβαν σιμβαστατίνη, η μεταγραφική ενεργότητα του Nrf2 αυξήθηκε σημαντικά και το mRNA δύο γνωστών στόχων του Nrf2, ΗΟ-1 (Heme Oxygenase 1) και GPX-2 (Glutathione Peroxidase 2) αυξήθηκε. Σε ST-2 κύτταρα μόνιμα διαμολυσμένα με πλασμίδιο που φέρει αλληλουχία DNA στην οποία προσκολλάται ο Nrf2 (ARE-Antioxidant Response Element) (ARE-ST2 κύτταρα), η σιμβαστατίνη αύξησε τη μεταγραφική ενεργότητα του Nrf2 με τρόπο εξαρτώμενο από το μεβαλονικό και ανεξάρτητο από τη χοληστερόλη. Επίσης, χρησιμοποιώντας πρωτογενείς καλλιέργειες εμβρυϊκών ινοβλαστών από μυς WT και ΚΟ-Nrf2 και μετρώντας τα επίπεδα των αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) μετά από επώαση με οξειδάση της γλυκόζης έπειτα από επίδραση ή μη με σιμβαστατίνη, διαπιστώθηκε ότι η σιμβαστατίνη μειώνει τα επίπεδα των παραχθέντων ROS στους WT ινοβλάστες και όχι σε μεγάλο βαθμό στους KO-Nrf2 ινοβλάστες. Τέλος, με τη χρήση αναστολέων του μονοπατιού της PI3K/Akt σε ARE-ST2 κύτταρα στα οποία είχαμε επιδράσει με σιμβαστατίνη, διαπιστώθηκε ότι αίρεται σε μεγάλο βαθμό η ενεργοποίηση του Nrf2 από τη σιμβαστατίνη. Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζεται για πρώτη φορά α) η ενεργοποίηση του Keap1/Nrf2 σηματοδοτικού μονοπατιού σε in vivo και in vitro μοντέλα από τη σιμβαστατίνη με τρόπο εξαρτώμενο από το μεβαλονικό και ανεξάρτητο από τη χοληστερόλη και β) ότι η σιμβαστατίνη μειώνει τα παραγόμενα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μέσω της ενεργοποίησης του Nrf2 διαμέσου του μοριακού μονοπατιού της PI3K/Akt. H ενεργοποίηση αυτή του Nrf2 από τη σιμβαστατίνη εκτός του ότι προσφέρει αποτελεσματική προστασία του κυττάρου από τις δυσμενείς επιπτώσεις του οξειδωτικού στρες, εξηγεί και μέρος των πλειοτροπικών δράσεων των στατινών.