Οι πολυμορφισμοί του γονιδίου του υποδοχέα της βιταμίνης D σε παιδιά με κοντό ανάστημα

Abstract

Introduction - Aim: Given the connection of vitamin D with growth, many researchers have studied the relationship between Vitamin D Receptor-VDR gene and growth parameters like height, weight and bone density. Idiopathic Short Stature (ISS) is diagnosed after excluding identifiable causes of short stature. Genetic studies have tried to shed light to the aetiology of this trait but only a minority of ISS cases can be attributed to these genes. Recently, a few studies have provided evidence of an apparent association of ISS with VDR gene polymorphisms. The aim of this dissertation was to investigate the involvement of the VDR gene in the appearance of ISS. For this purpose a comparative case- control study on the distribution of the VDR gene FokΙ, ApaΙ, BsmΙ, and TaqΙ polymorphisms was performed. The study included a group of children with ISS and a control group of normal height children, matched for age and gender, all of them from northern Greece. Secondary goal of this study was the search for a possible association between the above polymorphisms and growth parameters such as birth weight and length and also height during childhood and adolescence. Patients and Methods: The study population included 43 Caucasian children and adolescents with ISS, 4-16 years old, whose height was < -1,5 SD from the corresponding mean height of the age, gender and population group that they belong to. The control group included 61 children of the same age, gender and ethnic group with height ranging -1,5 <SD <+2. Exclusion criteria for the enrolment in the control group, were the existence of short stature, chronic or endocrine disease. A thorough history (perinatal, family and personal) was taken from all ISS families and each child underwent a thorough physical examination and extensive laboratory testing to exclude all identifiable causes of symmetric short stature. The next step was DNA isolation following extraction with commercial kits. The isolated DNA was used for the amplification - using the method of Polymerase Chain Reaction (PCR) - of the VDR gene parts containing the FokΙ, BsmΙ, TaqΙ and Apal polymorphisms. The amplified products were cleaved with the corresponding restriction endonucleases. Genotyping was accomplished using electrophoresis on agarose gel. Estimation of haplotype frequencies was accomplished by running the PHASE version 2.1 program. Results: There was no statistically significant deviation from the Hardy-Weinberg equilibrium with respect to any VDR polymorphism, in either group of children. The distributions of allele, genotype and haplotype frequencies of all four polymorphisms in the control group were similar with those reported for the Caucasian population. All the above are strong indications of the representativeness of the control group sample. In order to investigate the relationship between ISS and the VDR gene, the two groups were compared with respect to allele, genotype and haplotype frequencies of all four polymorphisms, both in all the children and in each gender separately. The comparison with respect to FoκΙ polymorphism, revealed that the FF and Ff genotypes occurred more frequently in ISS group compared to the control group while the ff was completely absent in the ISS group (p = 0,052). The odds of a person with ISS to have the ff, compared with other genotypes, were 92% lower than those of a person of normal stature (p = 0,021). The F allele occurred more frequently (statistically not significant) in the ISS group compared to the control group. Among same-gender individuals similar results applied. No statistically significant difference was found regarding BsmΙ, Apal and TaqΙ polymorphisms, both in all the children and in each gender separately. The same applied for the comparison considering BsmΙ, ApaΙ and TaqΙ haplotypes. When investigating the relationship between the height phenotype and VDR gene polymorphisms the following were discovered: regarding Fold polymorphism, in all of the children, a tendency for FF individuals to be shorter than Ff and ff was observed, (p=0,106). Also, ff children were significantly taller than FF+Ff as a group, (p=0,05). When studying each group or each gender separately, no statistically significant difference was found regarding FokΙ. In all groups of the children and male gender, height was not found to differ among individuals with different Bsml and Taql genotypes. Heterozygote girls were found to be taller than homozygotes. A tendency for tt children being shorter than Tt and TT was observed. No statistically significant differences were found concerning height among individuals of different ApaΙ genotype, in all the groups of children. Birth weight and length were not found to differ statistically among individuals of different FokΙ and ApaΙ genotype, in all groups of children. On the contrary, when analysing BsmΙ and TaqΙ polymorphisms, in all groups and both sexes, children with BB (tt) genotype tended to have lower birth weight and length than those with Bb (Tt), bb (TT) and Bb + bb (Tt + TT) genotypes. Conclusions: In the present dissertation, a possible involvement of the VDR gene FokΙ polymorphism in the development of the I SS phenotype was revealed. In agreement with previous studies, the transcriptionally more active F allele occurred more frequently in children with ISS in comparison to normal height children. On the contrary, ΒsmI, ApaI and TaqI polymorphisms and also the haplotypes resulting from them, were not found to be associated with ISS. Also, the results of the present dissertation, confirmed previous studies that support the hypothesis that FokI polymorphism seems to play a role in the determination of height in general. On the contrary, BsmI, TaqI and ApaI polymorphisms were not found to have a contribution in the formation of height. The present study supported the possible involvement of BsmI and TaqI polymorphisms in the determination of the size at birth, since children with BB (tt) genotype were found to have lower birth weight and length than children with other genotypes. Contrary to the relative bibliography, the above findings applied to both genders. In agreement with previous studies, weight and birth length were not found to differ among individuals of different FokI and ApaI genotypes. This is the third research attempt worldwide and the first in greek population to establish a relationship between VDR gene and ISS. The above dissertation provides evidence of VDR gene involvement in the development of ISS phenotype and in the determination of the anthropometric characteristics that were studied. More definitive conclusions will be drawn only after independent confirmation of the above results in other populations.

Εισαγωγή - Σκοπός: Δεδομένης της σύνδεσης της βιταμίνης D με τη σωματική αύξηση, πολλοί ερευνητές έχουν μελετήσει τη σχέση μεταξύ του γονιδίου του υποδοχέα της βιταμίνης D (Vitamin D Receptor - VDR) και παραμέτρων της ανάπτυξης όπως το ύψος, το βάρος και την οστική πυκνότητα. Το Ιδιοπαθές Κοντό Ανάστημα (ΙΚΑ) διαγιγνώσκεται όταν αποκλειστούν όλα τα γνωστά αίτια κοντού αναστήματος. Πολλές έρευνες ασχολήθηκαν με την αναζήτηση υποψήφιων γονιδίων για το γνώρισμα αυτό, ελάχιστες όμως περιπτώσεις ΙΚΑ μπορούν να αποδοθούν στα γονίδια αυτά. Πρόσφατα κάποιες μελέτες αναφέρουν την ύπαρξη μιας προφανούς σχέσης ανάμεσα στο ΙΚΑ και τους πολυμορφισμούς του γονιδίου VDR. Στην παρούσα διατριβή έγινε προσπάθεια να διαλευκανθεί η συμμετοχή του γονιδίου VDR στην εμφάνιση του ΙΚΑ. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη ανάμεσα σε ομάδα παιδιών με ΙΚΑ και σε ομάδα ελέγχου παιδιών με φυσιολογικό ανάστημα από τη Βόρειο Ελλάδα, αντίστοιχης ηλικίας και φύλου ως προς την κατανομή των πολυμορφισμών Fokl, ApaI, Bsml, και TaqI του VDR γονιδίου. Επιμέρους στόχος της έρευνας αποτέλεσε η αναζήτηση της πιθανής σχέσης ανάμεσα στους παραπάνω πολυμορφισμούς και παραμέτρων της αύξησης όπως το μήκος και βάρος γέννησης καθώς και το ύψος κατά την παιδική και εφηβική ηλικία. Ασθενείς - Μέθοδοι: Στην έρευνα συμπεριλήφθησαν 43 παιδιά και έφηβοι με ΙΚΑ, 4-16 ετών, καυκάσιας φυλής, με ύψος ≤-1,5 SD από το μέσο όρο του ύψους που αντιστοιχεί στην ηλικία, το φύλο και τον πληθυσμό στον οποίο ανήκουν. Στην ομάδα ελέγχου συμπεριλήφθησαν 61 παιδιά ίδιας ηλικίας, φύλου και φυλετικής ομάδας τα οποία είχαν ύψος με εύρος -1,5 < SD < +2. Κριτήρια αποκλεισμού, για την ένταξη στην ομάδα ελέγχου, αποτέλεσαν η ύπαρξη κοντού αναστήματος, χρόνιου ή ενδοκρινολογικού νοσήματος. Από όλες τις οικογένειες με ΙΚΑ έγινε λήψη ιστορικού (περιγεννητικού, κληρονομικού και ατομικού) και κάθε παιδί υποβλήθηκε σε λεπτομερή φυσική εξέταση και εκτενή εργαστηριακό έλεγχο, για να αποκλειστούν όλα τα γνωστά αίτια του συμμετρικού κοντού αναστήματος. Ακολούθησε απομόνωση DNA υλικού με τη χρήση ειδικού kit του εμπορίου. Το απομονωμένο DNA χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση - με τη μέθοδο της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR) - των τμημάτων εκείνων του VDR1 γονιδίου που περιέχουν τους πολυμορφισμούς FokI, Bsml, TaqI και ApaI. Το ενισχυμένο DNA επωάστηκε με τις αντίστοιχες ενδονουκλεάσες περιορισμού. Ο γονοτυπικός προσδιορισμός έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Ο προσδιορισμός των συχνοτήτων των απλοτύπων διενεργήθηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα PHASE (version 2.1). Αποτελέσματα: Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές αποκλίσεις από την ισορροπία Hardy-Weinberg για κανένα πολυμορφισμό, σε καμία ομάδα παιδιών. Και για τους τέσσερις πολυμορφισμούς, οι συχνότητες των αλληλομόρφων, των γονοτύπων και των απλοτύπων της ομάδας ελέγχου συμφωνούν με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας για Ευρωπαϊκούς πληθυσμούς. Τα παραπάνω αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για την αντιπροσωπευτικότητα του δείγματος της ομάδας ελέγχου. Για τη διερεύνηση της σχέσης ανάμεσα στο ΙΚΑ και το VDR γονίδιο, οι δύο ομάδες συγκρίθηκαν ως προς τις συχνότητες των αλληλομόρφων. των γονοτύπων και των απλοτύπων των πολυμορφισμών τόσο στο σύνολο όσο και σε κάθε φύλο χωριστά. Η σύγκριση ως προς τον πολυμορφισμό FokI, έδειξε ότι οι γονότυποι FF και Ff εμφανίστηκαν συχνότερα στην ομάδα ΙΚΑ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου ενώ αντίθετα ο ff είχε μηδενική παρουσία στην ομάδα IKA (p=0,052). Η πιθανότητα ένα άτομο με ΙΚΑ να έχει τον ff, έναντι των άλλων γονοτύπων, ήταν 92% μικρότερη από την ίδια πιθανότητα σε ένα άτομο φυσιολογικού αναστήματος (p=0,021). Το αλληλόμορφο F εμφανίστηκε συχνότερα (όχι σημαντικά) στην ομάδα ΙΚΑ σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Μεταξύ των ατόμων ίδιου φύλου ίσχυσαν παρόμοια (στατιστικά μη σημαντικά) αποτελέσματα. Διαφορά δεν εντοπίστηκε όταν οι δύο ομάδες συγκρίθηκαν ως προς τους πολυμορφισμούς BsmI, ΑpaI και TaqI. Το ίδιο ίσχυσε για κάθε φύλο χωριστά. Διαφορά επίσης δεν παρουσιάστηκε ως προς τους απλοτύπους των παραπάνω πολυμορφισμών. Όταν αναζητήθηκε η σχέση ανάμεσα στο ύψος των παιδιών και τους πολυμορφισμούς του VDR διαπιστώθηκαν τα εξής: για τον πολυμορφισμό FokI, στο σύνολο των παιδιών, παρατηρήθηκε η τάση τα άτομα FF να έχουν χαμηλότερο ύψος από τα Ff και τα ff, (p=0,106). Επίσης, τα ff ήταν σημαντικά ψηλότερα από το σύνολο FF+Ff, (p=0,05). Σε κάθε ομάδα και σε κάθε φύλο χωριστά δεν εντοπίστηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς το ύψος, για τον FokI. Σε όλες τις ομάδες των παιδιών και στο άρρεν φύλλο, το ύψος δε βρέθηκε να διαφέρει ανάμεσα στα άτομα με διαφορετικούς Bsml και TaqI γονοτύπους. Τα ετερόζυγα κορίτσια βρέθηκαν να είναι ψηλότερα από τα ομόζυγα. Σε όλες τις ομάδες των παιδιών παρατηρήθηκε η τάση, τα παιδιά με γονότυπο tt να είναι κοντότερα από τα παιδιά Tt+tt. Δεν βρέθηκαν διαφορές ως προς το ύψος ανάμεσα στα άτομα με διαφορετικό ΑραI γονότυπο σε όλες τις ομάδες των παιδιών. Το βάρος και μήκος γέννησης δε βρέθηκαν να διαφέρουν στατιστικά ανάμεσα στα άτομα με διαφορετικό FokΙ και ΑραΙ γονότυπο σε όλες τις ομάδες των παιδιών. Αντίθετα, για τους BsmΙ και Taql, σε όλες τις ομάδες και σε κάθε φύλο, παρατηρήθηκε η τάση τα παιδιά ΒΒ (tt) να έχουν χαμηλότερο βάρος και μήκος γέννησης από τα άτομα Bb (Tt) και bb (ΤΤ) καθώς και από το σύνολο των Bb+bb (Tt+TT). Συμπεράσματα: Στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε η πιθανή συμμετοχή του πολυμορφισμού FokΙ του VDR γονιδίου στη δημιουργία του φαινοτύπου του ΙΚΑ. Σε συμφωνία με προγενέστερες μελέτες, το μεταγραφικά δραστικότερο αλληλόμορφο F εμφανίστηκε συχνότερα στα κοντά άτομα σε σχέση με τα μη κοντά. Αντιθέτως, οι πολυμορφισμοί Bsml, ApaΙ και TaqΙ καθώς και οι απλότυποι που προκύπτουν από αυτούς, δε φάνηκε να παίζουν ρόλο στην εμφάνιση του ΙΚΑ. Επίσης, επιβεβαιώθηκαν προηγούμενες έρευνες οι οποίες βρήκαν ότι ο FokΙ πολυμορφισμός φαίνεται να παίζει γενικότερο ρόλο στον καθορισμό του ύψους. Συμμετοχή στη διαμόρφωση του αναστήματος αντίθετα δεν επιβεβαιώθηκε για τους πολυμορφισμούς Bsml, TaqΙ και ApaI. Διαπιστώθηκε ότι οι πολυμορφισμοί Bsml και Taql παίρνουν μέρος στον καθορισμό του μεγέθους κατά τη γέννηση καθώς βρέθηκε ότι τα παιδιά ΒΒ (tt) είχαν χαμηλότερο βάρος και μήκος γέννησης από τα άτομα Bb (Tt), bb (ΤΤ) και από το σύνολο Bb+bb (Tt+TT). Σε αντίθεση με τη σχετική βιβλιογραφία, η παραπάνω διαπίστωση αφορούσε και τα δύο φύλα. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες, το βάρος και μήκος γέννησης δε βρέθηκαν να διαφέρουν ως προς τους γονοτύπους FokΙ και ApaΙ. Η παραπάνω μελέτη αποτελεί την τρίτη σε διεθνές επίπεδο και την πρώτη στον Ελλαδικό χώρο, ερευνητική προσπάθεια αναζήτησης σχέσης ανάμεσα στο VDR γονίδιο και το ΙΚΑ. Προκύπτουν ενδείξεις σύνδεσης του VDR γονιδίου με το ΙΚΑ και τα σωματομετρικά χαρακτηριστικά που μελετήθηκαν. Η εξαγωγή οριστικών συμπερασμάτων θα πραγματοποιηθεί μετά από ανεξάρτητη επιβεβαίωση σε άλλες πληθυσμιακές ομάδες.