Υπό συνθήκη διάσωση φαινότυπων συσχετιζόμενων με το γονίδιο NR4A2: λειτουργικός συσχετισμός με την α-συνουκλεΐνη

Abstract

Parkinson's Disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder, afflicting 1% of the population over the age of 65. Loss of dopaminergic neurons in the Substatia Nigra (SN) and the formation of Lewy Bodies (LBs), protein inclusions rich in α-synuclein, are the major pathophysiological hallmarks of the disease. The characteristic motor symptoms in PD, arise due to a selective degeneration of the nigrostriatal pathway and the consequent disturbance in basal ganglia circuitry and Dopamine levels. To date, several genetic and environmental factors have been involved in the pathogenesis of PD, although the exact aetiology remains unknown. Nurr1 (NR4a2), a transcriptional factor required for the development and differentiation of Dopaminergic neurons, is one of the genes associated with PD. Since 2003, 6 Nurr1 mutations, that decrease mRNA levels, have been identified in PD patients. In humans, Nurr1 expression levels progressively decrease with aging. However, in PD patients they are further decreased, specifically in neurons affected with LB pathology. Importantly, Nurr1 levels are diminished when α-synuclein (ASYN), the major component of LBs, is over-expressed in cell lines and transgenic mice, while Nurr1 down-regulation in cell lines results in endogenous ASYN upregulation. α-synuclein, is another gene strongly associated with PD, since point mutations as well as gene duplications and triplications have been found in PD cases. In addition, ASYN protein levels progressively increase with aging in humans. ASYN, a natively unfolded protein abundant in presynaptic terminals, seems to play a critical role in synaptic plasticity and signal transduction. However, in pathological conditions, it forms toxic oligomers that accumulate in LBs. The present study aims to investigate the reciprocal relationship between Nurr1 and ASYN and its functional impact, not only in the Dopaminergic system, but in the Central Nervous System as well. Accordingly, we generated two “Double Hit” transgenic mouse lines (2Hit-DA(120) and 2Hit-CNS(A53T)), that over-express human ASYN in a Nurr1+/- background. Transgenic mice over-expressing the truncated ASYN-120 under the dopaminergic TH promoter and transgenic mice over-expressing the mutated ASYN-A53T, were crossed with Nurr1+/- mice, to generate the “double hit” lines 2Hit-DA(120) and 2Hit-CNS(A53T) respectively. ASYN-120 and ASYN-A53T are both highly toxic ASYN forms with elevated aggregation rate and are frequently found in PD patients. Our results, that include behavioral, biochemical and histopathological evaluation of the “double hit” mouse lines, suggest that Nurr1 and ASYN interplay has a major impact in dopaminergic functions. 2Hit-DA(120) mice, that over-express ASYN-120 in a Nurr1+/- background, show an early dopaminergic disregulation, that is characterised by diminished DA and DAT levels in the striatum at the age of 4 months. Unexpectedly, locomotor activity in these mice is significantly elevated. Since locomotor activity has been shown to correlate positively with the amount of extracellular dopamine, that is normally reuptaken from the synaptic cleft by DAT, we conclude that hyperactivity in this model is a consequence of Dopamine reuptake disturbances. The synergistic impact of Nurr1 and ASYN on dopaminergic function is further confirmed in the double hit line 2Hit-CNS(A53T). In this experimental system, ASYN over expression has a significant enhancing effect on DA levels when Nurr1 is normally expressed, while Nurr1+/- mice don’t show any differences when compared with wild type animals. On the contrary, parallel ASYN over-expression and Nurr1 down-regulation confers a significant reduction of DA levels. The behavioral effects of this disregulation are reduced locomotor activity and shorter stride length, phenotypes consistent with diminished DA levels. Most importantly, after the age of 12 months, 40% of these mice develop a severe and lethal motor phenotype, that simulates many PD symptoms. Pathophysiologicaly, the motor phenotype is correlated with increased ASYN aggregation in the spinal cord, while TH+ cell bodies in SN and their projections to the striatum remain in tact. In conclusion, our study demonstrates that the reciprocal relationship between Nurr1 and ASYN has substantial effects on the integrity of dopaminergic functions in vivo, while the expression pastern of ASYN seems to be a determining factor for the resulting phenotypic outcomes. Additionally, it is shown for the first time that genetic factors, in particular Nurr1 and ASYN, may synergistically affect dopaminergic function, leading to PD-like motor phenotypes. However, since in our experimental systems Nurr1 expression is constantly down-regulated thourghout development, the observed pathology could be emerging from early readjustments during neuronal differentiation. Aiming to investigate this hypothesis, we are creating a conditional rescue “Tet-Off” mouse model, where developmental interferences can be ruled out, by turning off Nurr1 expression during adulthood. This model could make an ideal tool for evaluating the role of Nurr1 in dopaminergic system maintenance, and its potential association with pathophysiological mechanisms underlying PD.

Η νόσος Πάρκινσον είναι μια προοδευτική, νευροεκφυλιστική νόσος, που προσβάλλει το 1% του πληθυσμού ηλικίας άνω των 65 ετών. Βασικά παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά της νόσου αποτελούν η απώλεια ντοπαμινεργικών νευρώνων και η παρουσία των σωματίων Lewy, πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων πλούσιων στην πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη. Στη ΝΠ οι ντοπαμινεργικοί νευρώνες, που ξεκινούν από τη μέλαινα ουσία και νευρώνουν το ραβδωτό σώμα, σταδιακά εκφυλίζονται, με αποτέλεσμα τη μείωση των επιπέδων ντοπαμίνης και την εμφάνιση κινητικών συμπτωμάτων. Η ακριβής αιτιολογία της ΝΠ δεν είναι ως σήμερα γνωστή, ενώ διάφοροι γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες έχουν αναδειχθεί για τη συμμετοχή τους στην έναρξη και εξέλιξη της νόσου. Ένα από τα γονίδια που έχουν συσχετιστεί με τη ΝΠ είναι το Nurr1, ένας μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για την ανάπτυξη και διαφοροποίηση των ντοπαμινεργικών νευρώνων. Από το 2003 μέχρι σήμερα έχουν εντοπιστεί 6 μεταλλάξεις του Nurr1 σε ασθενείς με ΝΠ, οι οποίες μειώνουν τα επίπεδα του mRNA. Επιπλέον, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του Nurr1 μειώνονται προοδευτικά με την ηλικία, σε ασθενείς με ΝΠ παρατηρείται περαιτέρω μείωση και μάλιστα ειδικά σε νευρώνες με σωμάτια Lewy. Όπως έχει δειχθεί από πειράματα σε κυτταρικές σειρές, αλλά και ποντίκια, ο Nurr1 έχει μια σχέση αντίστροφης ρύθμισης με την α-συνουκλεΐνη, καθώς η υπερέκφραση της α-συνουκλεΐνης προκαλεί μείωση του Nurr1. Αντίστοιχα, μείωση του Nurr1 με shRNA επιφέρει αύξηση της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης σε κυτταρικές σειρές. Όπως και ο Nurr1, η α-συνουκλεΐνη συσχετίζεται έντονα με τη ΝΠ, καθώς αποτελεί το βασικό συστατικό των σωματίων Lewy, ενώ τόσο μεταλλάξεις, όσο και διπλασιασμοί και τριπλασιαμοί του γονιδίου έχουν βρεθεί σε ασθενείς με ΝΠ. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης της α-συνουκλεΐνης αυξάνονται προοδευτικά με την ηλικία. Η α-συνουκλεΐνη (ASYN) είναι μια εγγενώς εύκαμπτη πρωτεΐνη, που εντοπίζεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στις προσυναπτικές απολήξεις και ο φυσιολογικός της ρόλος φαίνεται να σχετίζεται με τη συναπτική μεταγωγή και πλαστικότητα. Ωστόσο, σε παθολογικές καταστάσεις όπως η ΝΠ, αναδιπλώνεται σχηματίζοντας τοξικά ολιγομερή που συσσωρεύονται στα σωμάτια Lewy. Στην παρούσα μελέτη, θελήσαμε να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς παθογένειας της ΝΠ, μελετώντας τις λειτουργικές επιπτώσεις της αντίστροφης ρύθμισης του Nurr1 και της ASYN, τόσο στο ντοπαμινεργικό σύστημα, όσο και στο ευρύτερο ΚΝΣ. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήσαμε δυο διαγονιδιακές σειρές ποντικιών που υπερεκφράζουν ανθρώπινη ASYN ενώ είναι ημίζυγα για το Nurr1. Η πρώτη (σειρά 2Hit-DA(120)), υπερεκφράζει την περικομμένη ASYN-120 υπό το ντοπαμινεργικό υποκινητή της ΤΗ, ενώ η δεύτερη (σειρά 2Hit-CNS(A53T)) τη μεταλλαγμένη ASYN-Α53Τ υπό τον πανευρωνικό υποκινητή Prion. Πρόκειται για δυο πρωτεϊνικές μορφές με αυξημένη τοξικότητα, που σχετίζονται με ταχύτερο ρυθμό συσσωμάτωσης και έχουν βρεθεί σε ασθενείς με ΝΠ. Αναλύοντας τους σχετικούς φαινοτύπους σε επίπεδο συμπεριφορικό, βιοχημικό και ιστολογικό, διαπιστώσαμε ότι η αντίστροφη ρύθμιση των δυο αυτών παραγόντων επιφέρει σημαντικές επιπτώσεις στη λειτουργία του ντοπαμινεργικού συστήματος και μάλιστα με τρόπο συνεργιστικό. Τα ποντίκια που υπερεκφράζουν την ASYN-120 στο ντοπαμινεργικό σύστημα ενώ είναι ημίζυγα για το Nurr1 (σειρά 2Hit-DA(120)), παρουσιάζουν μια πρώιμη διαταραχή του ντοπαμινεργικού συστήματος, που χαρακτηρίζεται από μείωση τόσο των επιπέδων ολικής ντοπαμίνης, όσο και του μεταφορέα της (DAT), στο ραβδωτό. Ο φαινοτυπικός αντίκτυπος της διαταραχής αυτής συνοψίζεται σε μια σημαντική αύξηση της κινητικής δραστηριότητας, συμπεριφορά η οποία εξαρτάται με τρόπο ανάλογο από τη δράση της εξωκυττάριας ντοπαμίνης στη συναπτική σχισμή. Καθώς η παραμονή της ντοπαμίνης στον εξωκυττάριο χώρο καθορίζεται από το ρυθμό επαναπρόσληψης της, που επιτελείται από το DAT, συμπεραίνουμε ότι παρατηρούμενη υπερκινητικότα οφείλεται στη μείωση των επιπέδων του τελευταίου. Η συνεργιστική επίδραση του Nurr1 και της ASYN στη λειτουργία του ντοπαμινεργικού συστήματος επιβεβαιώνεται και στη διαγονιδιακή σειρά 2Hit-CNS(A53T), όπου τα Nurr1+/- ποντίκια εμφανίζουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα ντοπαμίνης σε σχέση με τα Nurr1+/+, μόνο όταν ταυτόχρονα υπερεκφράζεται η ASYN-Α53Τ. Η απορρύθμιση του ντοπαμινεργικού συστήματος γίνεται εμφανής και σε επίπεδο συμπεριφοράς, καθώς τα ποντίκια αυτά έχουν χαμηλότερα επίπεδα ελεύθερης δραστηριότητας και μικρότερο μήκος βηματισμού. Επιπλέον, μετά την ηλικία των 12 μηνών, στο 40% των ποντικιών παρουσιάζεται ένας πιθανόν παρκινσονικός κινητικός φαινότυπος, που χαρακτηρίζεται από δυσκαμψία σε όλο το σώμα και τελικά οδηγεί στο θάνατο. Σε επίπεδο παθοφυσιολογίας, δεν παρατηρείται απώλεια ντοπαμινεργικών νευρώνων της μέλαινας ουσίας ή των απολήξεων τους στο ραβδωτό σώμα, ενώ ο φαινότυπος αυτός συνοδεύεται από αυξημένη συσσωμάτωση ASYN στο νωτιαίο μυελό. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης καταδεικνύουν ότι η αντίστροφη ρύθμιση των δυο αυτών πρωτεϊνών έχει σημαντικές επιπτώσεις στη λειτουργία του ντοπαμινεργικού συστήματος και ότι η φύση των επιπτώσεων αυτών εξαρτάται από την έκφραση της α-συνουκλεΐνης. Επιπλέον, για πρώτη φορά φαίνεται ότι ο Nurr1 μπορεί να λειτουργεί συνεργιστικά με άλλους γενετικούς παράγοντες, στη προκειμένη περίπτωση με την α-συνουκλεΐνη, επηρεάζοντας την ισορροπία του ντοπαμινεργικού συστήματος και το κυριότερο, προκαλώντας σοβαρούς κινητικούς φαινοτύπους που προσομοιάζουν στη ΝΠ. Καθώς στο πειραματικό μας σύστημα η έκφραση του Nurr1 είναι μειωμένη καθόλη τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, οι παρατηρούμενες λειτουργικές επιπτώσεις είναι δυνατόν να αποτελούν αποκύημα αναπροσαρμογών κατά τη διαφοροποίηση του νευρικού συστήματος. Προκειμένου να διερευνήσουμε την παραπάνω υπόθεση, κατασκευάζουμε ένα μοντέλο «υπό συνθήκη διάσωσης» χρησιμοποιώντας το σύστημα «Τet-Off» σε ποντίκια. Το σύστημα αυτό, που επιτρέπει την κατά βούληση αποσιώπηση του Nurr1 οποιαδήποτε στιγμή, μπορεί να αποτελέσει πολύτιμο εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου του Nurr1 στη διατήρηση της λειτουργικότητας του ντοπαμινεργικού συστήματος και της εμπλοκής του στους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς της ΝΠ