Μελέτη μεταλλαγών στο γονίδιο της καρδιακής τροπονίνης Τ σε Έλληνες ασθενείς που πάσχουν από υπερτροφική μυοκαρδοπάθεια

Abstract

Introduction: Hypertrophic cardiomyopathy is an autosomal, dominant familial disease (90%), with sporadic cases happening less than 10%. It is the first cause of sudden cardiac death at ages below 30, with a prevalence of 1/500 in the general population. The involved genes, encoding mostly sarcomeric proteins, are fourteen and the associated mutations are 418. Penetrance is in correlation to the associated pathologic gene. Hypertrophic cardiomyopathy patients, due to cardiac troponin T mutations, have a high risk of sudden cardiac death, even at the absence of any prior symptom. At the initial studies, cardiac troponin T was the third gene with a 15% prevalence, in relation to the disease. Incomplete penetrance, as evidenced electrocardiographically and echocardiographically, is one of the main characteristics of the cardiac troponin T-associated disease. Identification of disease causing mutations at probands will, also, help at the identification of 1st degree relatives, with subclinical or no forms of disease, who are gene carriers. Aim: The aim of the study, is the identification of mutations at the gene of cardiac troponin T in a representative Greek hypertrophic cardiomyopathy population and its penetrance. For this cause one hundred and forty three consecutive, unrelated patients-probands (diagnosis based on clinical and echocardiographic data) were genetically screened. Methods: All 16 exons of the gene were examined. Genetic screening consisted in multiplying each exon or region by the use of polymerase chain reaction (PCR) with specially designed primers for each exon and followed by the use of single strand conformation polymorphism (SSCP), at two, different, temperatures. In cases where there has been a deviation of the single stranded product from the conformation that a normal one would have in a polyacrylamide gel, the use of automated sequencing followed. Where there was sequencing evidence of deviation from the normal sequence, the procedure was repeated with use of fresh blood sample and automated sequencing of the region in question towards both directions (5’-3’ and 3’-5’). In cases of carrier probands’ relatives, genetic screening was carried out by the use of PCR, SSCP and automated sequencing (bidirectional) for the deviated, from normal, single strand conformers of the respective, in question, exon. In each case, deviation from the normal sequence was cross checked against DNA from 100 healthy individuals of Greek origin (200 chromosomes) -general population- so as to identify the presence of mutation or polymorphism. Results: Four (4) probands (three men, one woman) from different families were found with a mutation in the gene of cardiac troponin T. Three mutations were found in two amino acids on the same exon, exon 16. Those mutations were: Arginine-Cysteine, position 278, 2 persons, Arginine-Proline, position 278, 1 person and Arginine-Cysteine, position 286, 1 person. The clinical course and prognosis is different amongst them and each one of them. First degree, and beyond, relatives were informed and participated to the genetic investigation. In total 27 relatives were clinically examined and 18 genetically. Six (6) relatives were found to be gene carriers of the respective mutations, not excibiting, in all cases, the clinical type of the disease. Only 50% of the genetically affected persons fulfilled the typical echocardiographic criterion of left ventricular hypertrophy >13mm. whereas 30% of relatives identified as carriers did not have any clinical or subclinical criterion fulfilled. Those two informations, on their own, underline the need of broad spectrum genetic screening of probands as well as of their relatives. Discussion: The prevalence of cardiac troponin T gene mutations in Greece has been calculated to 2,8%, contrary to the previous international studies, but in accordance to the latest three studies. This study, along with the other three international studies, adds to the knowledge of the low prevalence of cardiac troponin T mutations in HCM proband populations. Correlation of phenotypes with respective genotypes has shown that genetic approach solely, cannot determine the clinical presence, and needs further investigation. Nevertheless, the genetic approach is undoubtfully a very strong “tool” for the identification of subclinical and silent cases of the disease, in the family. Patient evaluation by use of clinical or even subclinical criteria is not adequate for the identification of all hypertrophic cardiomyopathy carriers, whereas the addition of genetic analysis data will bring on a substantial depth in the diagnostics, the therapeutic route and the prevention of the disease.

Εισαγωγή: Η υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια είναι μια γενετικά καθοριζόμενη ασθένεια με αυτοσωματικό, κυρίαρχο χαρακτήρα κληρονομικότητας. Η κληρονομική μορφή καλύπτει το 90% της νόσου, ενώ σποραδικές μορφές, (κάτω του 10%) επίσης, υπάρχουν. Αποτελεί τη πρώτη αιτία αιφνίδιου θανάτου σε άτομα νεαρής ηλικίας, κάτω των 30 ετών, με επιπολασμό 1/500 στον γενικό πληθυσμό. Η διεισδυτικότητα της είναι συνάρτηση του εμπλεκομένου παθολογικού γονιδίου. Τα πλήρως διαπιστωμένα γονίδια σήμερα ανέρχονται σε δεκατέσσερα και οι μεταλλαγές τους σε 418. Κατά κύριο λόγο, αυτά μεταφράζονται σε πρωτεΐνες του σαρκομερίου. Άτομα με υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια λόγω μεταλλαγών στο γονίδιο της καρδιακής τροπονίνης Τ, έχουν κλινικά αυξημένο κίνδυνο αιφνίδιου θανάτου, ακόμα και χωρίς προηγούμενο σύμπτωμα. Στις αρχικές μελέτες, η τροπσνίνη Τ αποτελούσε το τρίτο, σε συχνότητα γονίδιο σχετιζόμενο με την ασθένεια, σε ποσοστό 15%. Η ατελής διεισδυτικότητα του φαινοτύπου, όπως αυτή καταγράφεται από ηλεκτροκαρδιογραφικούς και υπερηχοκαρδιογραφικούς παραμέτρους, είναι ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά της. Η αναγνώριση μεταλλαγών σε αυτό το γονίδιο, σε πρωτοεμφανιζόμενους ασθενείς - probands θα βοηθήσει και στην μετέπειτα αναγνώριση και συμβουλευτική των «υπό κίνδυνο» συγγενών που δεν πληρούν τα κλινικά, διαγνωστικά κριτήρια. Σκοπός: Ο σκοπός της μελέτης αυτής, είναι ο προσδιορισμός μεταλλαγών στο γονίδιο της καρδιακής τροπονίνης Τ σε δείγμα ελληνικού πληθυσμού και η διερεύνηση της συχνότητας εμφάνισης του. Για το λόγο αυτό ελέγχθηκαν 143 διαδοχικοί, μη σχετιζόμενοι μεταξύ τους, ασθενείς (διάγνωση βάσει κλινικών και υπερηχοκαρδιογραφικών δεδομένων) με υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια. Μέθοδοι: Εξετάσθηκε το σύνολο των 16 εξωνίων του γονιδίου. Ο γενετικός έλεγχος συνίστατο στον πολλαπλασιασμό τους, με τη βοήθεια αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), με ειδικούς εκκινητές για κάθε εξώνιο. Εν συνεχεία, ο έλεγχος πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της τεχνικής του πολυμορφισμού διαμόρφωσης μονόκλωνου DNA (single strand conformation polymorphism-SSCP), σε δύο θερμοκρασίες. Στις περιπτώσεις που παρουσιάστηκε διαφοροποίηση από την φυσιολογική διάταξη των υπό έλεγχο μονόκλωνων σε γέλη πολυακρυλαμιδίου, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της αλληλουχίας των τεσσάρων δομικών βάσεων του γενετικού κώδικα με τη βοήθεια αυτόματης ταυτοποίησης της αλληλουχίας (automated sequencing). Κατά τη διαπίστωση διαφοροποίησης από την φυσιολογική αλληλουχία, επαναλαμβανόταν η διαδικασία με νέο δείγμα αίματος και ταυτοποίηση της συγκεκριμένης αλληλουχίας και προς τις δύο κατευθύνσεις (5’-3’ και 3’-5’). Στην περίπτωση συγγενών ασθενών με μεταλλαγή, ο γενετικός έλεγχος πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια PCR, SSCP και επακόλουθη αυτόματη ταυτοποίηση της αλληλουχίας (δύο φορών) της συγκεκριμένης, υπό έλεγχο, περιοχής ούτως ώστε η εύρεση μεταλλάξεως να είναι 100% πιστοποιημένη. Σε κάθε περίπτωση η εύρεση οποιοσδήποτε διαφοροποίησης από την φυσιολογική αλληλουχία, ελεγχόταν έναντι DNA 100 διαφορετικών φυσιολογικών ατόμων (200 χρωμοσώματα) του γενικού πληθυσμού, ούτως ώστε να διαφοροποιηθεί η ύπαρξη μεταλλαγής από αυτή πολυμορφισμού. Αποτελέσματα. Οι μεταλλαγές που βρέθηκαν, στο γονίδιο της καρδιακής τροπονίνης Τ, αφορούσαν τέσσερις πρωτοεμφανιζόμενους ασθενείς-probands (3 άνδρες, 1 γυναίκα) από τέσσερις διαφορετικές οικογένειες. Οι μεταλλαγές ήταν τρεις, σε δύο διαφορετικές θέσεις της ίδιας περιοχής του γονιδίου, το καταληκτικό εξώνιο 16. Οι μεταλλαγές ήταν οι: Αργινίνη-Κυστεΐνη, θέση 278, 2 άτομα, Αργινίνη-Κυστεΐνη, θέση 286,1 άτομο, Αργινίνη-Προλίνη, θέση 278, 1 άτομο. Η κλινική πορεία και πρόγνωση τους είναι διαφέρει σε κάθε περίπτωση. Ενημερώθηκαν συγγενείς 1ου και πέρα βαθμών για περαιτέρω έλεγχο. Συνολικά, 27 συγγενείς ελέγχθησαν κλινικά ενώ γενετικά 18. 6 συνολικά συγγενείς βρέθηκαν να είναι φορείς των μεταλλαγών έχοντας κατά περιπτώσεις και τα χαρακτηριστικά στοιχεία της νόσου. Μόνο 50% των γενετικά επηρεαζόμενων ατόμων πληρούσαν το κλασσικό υπερηγοκαρδιογραφικό κριτήριο της αριστερής κοιλιακής υπερτροφίας >13mm. ενώ 30% των συγγενών πιστοποιήθηκαν σαν Φορείς, μόνο, μέσω της γενετικής διάγνωσης. Τα δύο αυτά στοιχεία και μόνο τονίζουν την ανάγκη για εκτεταμένο γενετικό έλεγχο των πρωτοεμφανιζόμενων ασθενών και των συγγενών τους. Συζήτηση: Ο επιπολασμός των μεταλλαγών του γονιδίου της καρδιακής τροπονίνης Τ στον ελληνικό πληθυσμό ανέρχεται στο ποσοστό του 2,8%, σε αντίθεση με αντίστοιχες παλαιότερες διεθνείς μελέτες, συμφωνώντας όμως με τις τρεις τελευταίες διεθνείς μελέτες. Η μελέτη, αυτή σε συνδυασμό με τις νεότερες προσφέρει στη διεθνή βιβλιογραφία τη γνώση του χαμηλού ποσοστού των μεταλλάξεων της καρδιακής τροπονίνης Τ σε πληθυσμούς ασθενών με υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια. Η συσχέτιση των κλινικών εκφράσεων των ατόμων αυτών με τους αντίστοιχους γονότυπους επέδειξε ότι το γενετικό υπόστρωμα δεν μπορεί να προσδιορίσει την κλινική εικόνα και χρήζει περαιτέρω διερευνήσης. Παρόλα αυτά παραμένει ένα αδιαμφισβήτητης αξίας εργαλείο για τον εντοπισμό υποκλινικών και σιωπηλών περιπτώσεων της νόσου, ιδιαίτερα μέσα στην οικογένεια Η αξιολόγηση, με κλινικά και υποκλινικά κριτήρια και μόνο δεν είναι αρκετή για την διάγνωση φορέων υπερτροφικής μυοκαρδιοπάθειας ενώ ο συγκερασμός με στοιχεία της γενετικής ανάλυσης θα αποφέρει σημαντική διεύρυνση στον τομέα της διαγνωστικής, της θεραπευτικής και της πρόληψης.