Μοριακή ανάλυση του μεταβολισμού του σιδήρου και άλλων χαρακτηριστικών μορίων στη μυελική και λεμφική σειρά

Abstract

In the present thesis, we evaluated mRNA and protein expression of several molecules critical for B cell function (CD23, CD25, CD27, CD38, CD79b, CD71 and TfR2) in CD19+ B cells from 10 normal donors and 95 CLL patients. We also investigated the mechanisms regulating the expression of the above mentioned surface antigens and their possible differences between normal and leukemic B cells. Moreover, we tried to assess any possible association between antigen expression and clinical or biological parameters, such as disease clinical stage, chromosomal abnormalities and IGHV gene mutational status. In CLL, surface antigens CD23, CD25, CD38, CD79b and transferrin receptors TfR1 and TfR2 showed great divergence in both mRNA (analysed by Real-Time PCR) and protein (analysed by Western Blotting) levels; no mRNA and protein levels correlation could be discerned. Protein expression was irrelevant to their corresponding mRNA levels, thus indicating post-transcriptional mechanisms regulating CD23, CD25, CD38, CD79b, CD71 and TfR2 expression in CLL B cells. To further investigate the mechanisms regulating transferrin receptors gene expression, CLL B cells were cultured in the presence of actinomycin D and cycloheximide. This treatment did not affect TfR1/TfR2 mRNA expression, indicating predominantly posttranscriptional regulation. CD27 presents different expression pattern with mRNA and protein levels linear correlation, indicating transcriptional mechanisms regulating CD27 expression in CLL B cells. Analysis of possible correlations between mRNA and/or surface protein expression and clinico-biological parameters revealed significantly higher CD38 mRNA levels in CLL patients of advanced stages compared to Binet stage A patients. CD23, CD25, CD79b, CD27, CD71 and TfR2 expression showed no correlation with clinical stage at diagnosis. Moreover, patients with trisomy 12 showed 2-fold higher CD79b protein levels and higher CD27 mRNA levels, in contrast to patients with normal karyotype. CD23, CD25, CD38, CD71 and TfR2 expression showed no correlation with trisomy 12 or deletion 13q. Patients with unmutated IGHV sequences showed higher CD38 mRNA and CD79b protein levels and quite lower CD25 mRNA levels compared to patients with mutated sequences. Finally, CD23, CD27, CD71 and TfR2 showed similar expression, regardless IGHV gene mutations. In normal CD19+ B cells, CD23 and CD79b mRNA levels showed great divergence, with no correlation between mRNA and protein levels. CD38 and CD25 mRNA levels showed minor divergence among different donors, while the corresponding proteins were not detected in normal B cells under study. CD27 mRNA levels were quite high in all normal samples, in accordance to their protein levels. TfR1/2 mRNA and protein expression showed direct correlation and limited variation among normal B cells, contrary to CLL samples. Treatment of normal B cells with actinomycin D and cycloheximide designated the transcriptional regulation of both TfR1/TfR2 expression. Finally, CD23 and CD79b expression seems to be mainly regulated by post-transcriptional mechanisms, whereas CD25, CD27 and CD38 expression appears to be regulated by transcriptional mechanisms.

Στη συγκεκριμένη εργασία μελετήθηκε η έκφραση των κυτταρικών δεικτών CD23, CD25, CD27, CD38, CD79b, CD71 (TfR1) και TfR2 σε λευχαιμικά Β λεμφοκύτταρα 95 ασθενών με ΧΛΛ και φυσιολογικά Β λεμφοκύτταρα 10 υγιών ατόμων. Παράλληλα, διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί που ελέγχουν την έκφραση των χαρακτηριστικών αυτών μορίων καθώς και οι πιθανές διαφορές στη ρύθμιση της έκφρασής τους στα φυσιολογικά έναντι των λευχαιμικών Β λεμφοκυττάρων. Tαυτόχρονα, ελέγχθηκε η συσχέτιση της έκφρασης των χαρακτηριστικών μορίων της ΧΛΛ με σημαντικούς κλινικο-βιολογικούς παράγοντες, όπως το status μεταλλάξεων των γονιδίων των ανοσοσφαιρινών, το στάδιο της νόσου και οι χρωμοσωμικές ανωμαλίες των ασθενών.Στη ΧΛΛ οι υποδοχείς τρανσφερρίνης (TfR1/TfR2), καθώς και τα αντιγόνα επιφάνειας CD23, CD25, CD38 και CD79b παρουσίαζαν σημαντική αναντιστοιχία έκφρασης mRNA μεταγράφων (προσδιορισμένων με Real-Time PCR) και πρωτεϊνών (προσδιορισμένων με Western Blotting), εύρημα που υποδηλώνει τον έλεγχο της έκφρασής τους σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Η ρύθμιση της έκφρασης των TfR1 και TfR2 μελετήθηκε περαιτέρω σε καλλιέργειες λευχαιμικών Β λεμφοκυττάρων με προσθήκη των αναστολέων μεταγραφής- ακτινομυκίνη D και μετάφρασης- κυκλοεξαμίδη. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ως κυρίαρχη τη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης των υποδοχέων TfR1 και TfR2-α/TfR2-β. Το αντιγόνο επιφάνειας CD27 διαφοροποιήθηκε από τα άλλα μόρια, παρουσιάζοντας σημαντική αναλογία έκφρασης mRNA μεταγράφων και πρωτεϊνών, υποκείμενο κυρίως σε μεταγραφική ρύθμιση έκφρασης. Η συσχέτιση με σημαντικούς κλινικο-βιολογικούς παράγοντες έδειξε αυξημένη έκφραση των CD38 mRNA μεταγράφων στους ασθενείς των προχωρημένων σταδίων της ΧΛΛ, έναντι των ασθενών σταδίου Α και απουσία συσχέτισης των CD23, CD25, CD79b, CD27, CD71 και TfR2 με το κλινικό στάδιο κατά τη διάγνωση. Επίσης προέκυψε ότι ασθενείς με τρισωμία 12 παρουσίαζαν διπλάσια επίπεδα πρωτεΐνης CD79b και αυξημένα επίπεδα CD27 mRNA μεταγράφων συγκριτικά με τους ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο. Η έκφραση των CD23, CD25, CD38, CD71 και TfR2 δεν εμφάνιζε άμεση συσχέτιση με την έλλειψη 13q ή την τρισωμία 12. Τέλος, οι ασθενείς με αμετάλλακτες IGHV αλληλουχίες εμφάνιζαν υψηλότερα επίπεδα CD38 mRNA μεταγράφων και CD79b πρωτεΐνης, και σαφώς χαμηλότερα επίπεδα CD25 mRNA μεταγράφων έναντι των ασθενών με μεταλλαγμένες αλληλουχίες. Η έκφραση των αντιγόνων CD23, CD27, CD71 και TfR2, παρουσιάστηκε ανεξάρτητη από το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV. Στα φυσιολογικά CD19+ Β λεμφοκύτταρα, τα CD23 και CD79b mRNA μετάγραφα παρουσίαζαν ευρεία διακύμανση, ανεξάρτητη από τα υψηλά επίπεδα των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Τα επίπεδα έκφρασης των CD38 και CD25 mRNA μεταγράφων ήταν ιδιαίτερα χαμηλά και οι αντίστοιχες πρωτεΐνες δεν ανιχνεύθηκαν στα Β λεμφοκύτταρα των υγιών ατόμων. Τα CD27 mRNA μετάγραφα και πρωτεΐνες παρουσίαζαν υψηλά και συγκρίσιμα, μεταξύ των δειγμάτων, επίπεδα. Μετά την προσθήκη ακτινομυκίνης D και κυκλοεξαμίδης στις καλλιέργειες των φυσιολογικών Β λεμφοκυττάρων προέκυψε ότι ο έλεγχος της έκφρασης των υποδοχέων τρανσφερρίνης (TfR1/TfR2) πραγματοποιείται κυρίως σε επίπεδο μεταγραφής. Επιπλέον, η έκφραση των CD23 και CD79b ελέγχεται κυρίως μέσω μετα-μεταγραφικών μηχανισμών, σε αντίθεση με τα CD25, CD27 και CD38 των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται κυρίως μέσω μεταγραφικών μηχανισμών.