Μελέτη των μορίων CD40 και CD154 στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα και τα κύτταρα του αιμοποιητικού μικροπεριβάλλοντιος πασχόντων από σύνδρομα μυελικής ανεπάρκειας

Abstract

Objective. Patients with systemic lupus erythematosus (SLE) display increased apoptosis of bone marrow (BM) CD34+ hematopoietic progenitor cells. This study was undertaken to evaluate the expression of CD40 and CD40L in the BM of SLE patients, and to explore the possible involvement of these molecules in apoptosis of CD34+ cells. Methods. The proportion and survival characteristics of CD40+ cells within the BM CD34+ fraction from SLE patients and healthy controls were evaluated by flow cytometry. The production of CD40L by BM stromal cells was assessed using longterm BM cultures and the effect of CD40L on the survival characteristics and clonogenic potential of CD34+ cells was evaluated ex vivo by flow cytometry and clonogenic assays. Results. SLE patients displayed an increased proportion of CD40+ cells within the CD34+ fraction as compared with controls. The CD34+CD40+ subpopulation contained an increased proportion of apoptotic cells compared with the CD34+CD40? fraction in patients and controls, suggesting that CD40 is involved in the apoptosis of CD34+ cells. Stimulation of patients’ CD34+ cells with CD40L increased the proportion of apoptotic cells and decreased the proportion of colony-forming cells as compared with untreated cultures. The CD40L-mediated effects were amplified following treatment with recombinant Fas ligand, suggesting that the effects of these ligands are synergistic. CD40L levels were significantly increased in long-term BM culture supernatants and adherent layers of BM cells from SLE patients as compared with controls. Conclusion. These data reveal a novel role for the CD40/CD40L dyad in SLE by demonstrating that upregulation and induction of CD40 on BM CD34+ cells from patients with SLE contribute to the amplification of Fas-mediated apoptosis of progenitor cells

Εισαγωγή: Οι ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ) εμφανίζουν αυξημένη, Fas-επαγόμενη, απόπτωση των μυελικών προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Το CD40, μέλος της οικογένειας των υποδοχέων του TNF, και ο συνδέτης του CD40Ligand (CD40L), έχουν εμπλακεί στην παθοφυσιολογία του ΣΕΛ. Σε ορισμένους τύπους κυττάρων έχει αποδειχτεί μία προ-αποπτωτική δράση του CD40 μέσω επαγωγής της έκφρασης του Fas. Δεν είναι γνωστό, ωστόσο, εάν μια τέτοια συνεργική αλληλεπίδραση μεταξύ CD40 και Fas εμπλέκεται και στην απόπτωση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Σκοπός της εργασίας είναι η μελέτη (α) της κατανομής και του βιολογικού ρόλου των μορίων CD40/CD40L στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα του μυελού και τα κύτταρα του αιμοποιητικού περιβάλλοντος και (β) της σχέσης και αλληλεπίδρασης των μορίων CD40/CD40L με το Fas στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, σε ασθενείς με ΣΕΛ και υγιείς μάρτυρες. Ασθενείς και μέθοδοι: Μελετήθηκαν δείγματα μυελού από 20 ασθενείς με ΣΕΛ και 20 υγιείς εθελοντές, αντίστοιχης ηλικίας και φύλου. Προσδιορίστηκε η έκφραση των μορίων Fas και CD40 στα CD34+ κύτταρα καθώς και η βιωσιμότητα αυτών με κυτταρομετρία ροής. Για τη μελέτη του βιολογικού ρόλου του CD40 στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, ανοσομαγνητικά διαχωρισθέντα CD34+ κύτταρα επωάστηκαν με ανασυνδυασμένο ανθρώπινο (recombinant human, rh) CD40L ή/και rhFasL και προσδιορίστηκαν (α) τα χαρακτηριστικά επιβίωσης με κυτταρομετρία ροής και (β) η κλωνογονική ικανότητα με κυτταροκαλλιέργειες. Η παραγωγή του CD40L από τα κύτταρα του αιμοποιητικού μικροπεριβάλλοντος μελετήθηκε σε στρωματικά κύτταρα μακρόχρονων μυελικών καλλιεργειών με RT-PCR και στα αντίστοιχα υπερκείμενα με ELISA. Η μελέτη του βιολογικού ρόλου του CD40 συμπληρώθηκε με την επίδραση εξουδετερωτικού αντισώματος αντί-CD40L σε βραχύχρονες καλλιέργειες μυελικών μονοπυρήνων κυττάρων. Αποτελέσματα: Το ποσοστό των CD34+ κυττάρων που εξέφραζαν το CD40 μόριο ήταν σημαντικά υψηλότερο στους ασθενείς με ΣΕΛ (10.79 ± 6.90) σε σχέση με τους 8 μάρτυρες (5.41 ± 2.89; P = .0061). Ο υποπληθυσμός των CD34+/CD40+ κυττάρων περιείχε αυξημένο ποσοστό αποπτωτικών κυττάρων, συγκρινόμενος με αυτόν των CD34+/CD40- κυττάρων τόσο στους ασθενείς (37.43 ± 18.24 έναντι 11.85 ± 9.72; P <.0001) όσο και στους υγιείς (23.07 ± 10.03 έναντι 5.42 ± 6.41; P <.0001), γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή του CD40 στην απόπτωση των CD34+ κυττάρων. Διέγερση CD34+ κυττάρων ασθενών με rhCD40L αύξησε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν Fas και μείωσε το ποσοστό των κλωνογόνων κυττάρων, συγκριτικά με κύτταρα στα οποία δεν είχε επιδράσει rhCD40L, ενώ η εξουδετέρωση του CD40L αύξησε το ποσοστό των κλωνογόνων κυττάρων στους ασθενείς (P=.005) αλλά όχι στους υγιείς μάρτυρες (P=.286). Οι βιολογικές δράσεις του CD40L ενισχύονταν μετά από προσθήκη rhFasL, γεγονός που υποδηλώνει συνεργική δράση αυτών των συνδετών. Τα επίπεδα του CD40L ήταν σημαντικά αυξημένα στα υπερκείμενα και στα στρωματικά κύτταρα μακρόχρονων μυελικών καλλιεργειών ασθενών, συγκριτικά με τους μάρτυρες (P = .0315 και P = .0061, αντίστοιχα). Συμπέρασμα: Τα παραπάνω δεδομένα υποδηλώνουν ένα νέο ρόλο του CD40 στην ομοιόσταση του μυελού καθώς αποδεικνύουν ότι η αλληλεπίδραση του συστήματος CD40/CD40L ενισχύει τον επαγόμενο από το Fas κυτταρικό θάνατο των CD34+ προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων