Μελέτη του ρόλου του γονιδίου ABCB6 στον ενδοκυττάριο μεταβολισμό του σιδήρου και στη λειτουργία φυσιολογικών και νεοπλασματικών κυττάρων

Abstract

The aim of this study was the evaluation of the function of the recently identified ABC transporter, ABCB6. It has been proposed that it plays a role both in intracellular iron metabolism and in multidrug resistance development in human malignancies, but its exact function has not been fully elucidated to date. The Abcb6 transporter resides in the mitochondrion and it has been implicated in iron sulfur (Fe-S) cluster assembly and heme synthesis pathway. We quantified the expression of ABCB6 at the mRNA level following in vitro treatments with substances that alter the intracellular iron concentration and affect the heme biosynthetic pathway. Furthermore we silenced the expression of the ABCB6 gene and assessed the Fe-S cluster assembly proccess. Our results show that ABCB6 expression is controlled at the transcriptional level and is affected by intracellular iron levels, but we were not able to define the exact mechanism or pathway in which the gene participates. Silencing ot the gene did not affect Fe-S cluster assembly in the cytoplasm. Most likely it seems that ABCB6 plays a role in the heme biosynthetic pathway, as its expression is coordinated with changes in heme synthesis. The second isoform of Abcb6 is located in the plasma membrane and elevated expression of ABCB6 has been associated with resistance development to chemotherapeutic drugs. We quantified the expression of ABCB6 and the well studied transporters ABCB1 and ABCG2 in patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia (AML). Expression data were correlated with other clinical parameters, response and disease outcome. There was a strong correlation between ABCB6 and ABCB1 expression and achievement of complete remission in AML patients. Both genes were overexpressed in primary resistant patients compared to responders. There was no correlation between ABCB6, ABCB1 and ABCG2 expression and relapse, disease free survival, overall survival, as well as prognostic factors, such as age, karyotype and FLT3-Internal Tandem Duplication. Expression of the three genes in samples obtained after induction chemotherapy was not correlated to achievement of remission. Only ABCG2 was found significantly overexpressed in patients which developed AML from preceeding myelodysplastic syndrome compared to de novo AML patients. Finally, short term treatment of the AML cell line HL-60 with the chemotherapeutic drugs Etoposide, Idarubicin and Cytarabine resulted in ABCB6 upregulation after exposure to Etoposide.

Στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη ρόλου του πρόσφατα αναγνωρισμένου γονιδίου ABCΒ6, που ανήκει στην οικογένεια των ABC μεταφορέων. Εξετάστηκαν τόσο η πιθανή συμμετοχή του στο μεταβολισμό του σιδήρου, όσο και στην εμφάνιση ανθεκτικότητας σε ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ). Καθώς το ABCB6 εδράζεται στο μιτοχόνδριο έχει προταθεί πιθανή συμμετοχή του τόσο στη σύνθεση των σιδηροθειούχων συμπλόκων, όσο και στο βιοσυνθετικό μονοπάτι της αίμης. Προκειμένου να ελεγχθούν οι παραπάνω υποθέσεις, μελετήθηκαν αρχικά οι μεταβολές της έκφρασης του γονιδίου μετά από επιδράσεις με ουσίες που τροποποιούν την ενδοκυττάρια συγκέντρωση σιδήρου και στη συνέχεια συσχετίστηκε η έκφρασή του με μεταβολές στη σύνθεση της αίμης. Η συμμετοχή του γονιδίου στη σύνθεση των σιδηροθειούχων συμπλόκων μελετήθηκε μετά από σίγαση του γονιδίου με τη μέθοδο του μικρού παρεμβαλλόμενου RNA. Από την παρούσα μελέτη προκύπτει ότι το γονίδιο ABCB6 επηρεάζεται από τα επίπεδα του ενδοκυττάριου σιδήρου στο μεταγραφικό επίπεδο, χωρίς όμως να είναι ξεκάθαρος προς το παρόν ο τρόπος με τον οποίο γίνεται αυτό ή το συγκεκριμένο μονοπάτι στο οποίο συμμετέχει το γονίδιο. Καταστολή της έκφρασης του γονιδίου ABCB6 δεν επηρέασε τη σύνθεση και εξαγωγή των σιδηροθειούχων συμπλόκων από το μιτοχόνδριο. Πιο πιθανό φαίνεται να εμπλέκεται στο βιοσυνθετικό μονοπάτι της αίμης, όπως έχει προταθεί και από τους Krishnamurthy και συνεργάτες (2006), καθώς μεταβολές στην έκφραση του γονιδίου «συντονίζονται» με μεταβολές στη σύνθεση της αίμης. Λειτουργικό ισόμορφο του γονιδίου ABCB6 έχει εντοπιστεί, εκτός από το μιτοχόνδριο, και στην κυτταρική μεμβράνη και αυξημένη έκφρασή του έχει συσχετιστεί με εμφάνιση ανθεκτικότητας σε χημειοθεραπευτικές ουσίες. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η έκφραση του γονιδίου ABCB6 και των γνωστών ABC μεταφορέων ABCB1 και ABCG2 σε νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ΟΜΛ. Τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν με τα κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά τους, άλλους προγνωστικούς παράγοντες καθώς και την πορεία της νόσου. Ανευρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των γονιδίων ABCB6 και ABCB1 και την επίτευξη πλήρους ύφεσης μετά τη θεραπεία εφόδου. Τα γονίδια αυτά παρουσίασαν στατιστικά σημαντική υπερέκφραση σε ασθενείς που δεν ανταποκρίθηκαν στη χημειοθεραπεία εφόδου σε σχέση με αυτούς που πέτυχαν πλήρη ύφεση. Αντίθετα δε βρέθηκε συσχέτιση ανάμεσα στην έκφραση των γονιδίων ABCB6, ABCB1, ABCG2 και στην πιθανότητα υποτροπής και τη συνολική επιβίωση. Ακόμη η έκφραση των παραπάνω γονιδίων δε σχετίστηκε με γνωστούς προγνωστικούς παράγοντες στην ΟΜΛ, όπως ο καρυότυπος, η ηλικία και η παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο FLT3. Η έκφραση των τριών γονιδίων κατά τον επανέλεγχο μετά τη θεραπεία εφόδου δε συσχετίστηκε με την επίτευξη ύφεσης. Το γονίδιο ABCG2 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε ασθενείς με ΟΜΛ που αναπτύχθηκε σε έδαφος μυελοϋπερπλαστικού συνδρόμου σε σχέση με τους ασθενείς με de novo ΟΜΛ. In vitro μελέτη σε κυτταρική σειρά οξείας μυελογενούς λευχαιμίας κατέδειξε ότι το γονίδιο ABCB6 υπερεκφράζεται μετά από έκθεση στη χημειοθεραπευτική ουσία Ετοποσίδη.