Μελέτη της έκφρασης της KIP2/CDKN1C στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

Knowing the status of molecules involved in cell-cycle-control in cancer is vital for therapeutic approaches aiming at their restoration. The p27KIP1 and p57KIP2 Cyclin-Dependent-Kinase-Inhibitor is a critical factors controlling normal cell-cycle. A comparative comprehensive analysis was performed in a series of 70 non-small-cell-lung-cancer (NSCLCs). The majority of cases showed significantly reduced expression of p57KIP2 as well as of its counterpart p27KIP1 compared to matched-normal specimens. Low p57KIP2 protein levels correlated with increased proliferation, which seems to be histological subtype preponderant. At mechanistic level, degradation by SKP2 was demonstrated, in vivo and in vitro, by siRNA-methodology, to be the most important down-regulating mechanism of p57KIP2 and p27KIP1 in NSCLC. Decreased p57Kip2-transcription complements the above procedure in lowering p57Kip2-protein levels. Methylation was the main cause of decreased p57KIP2-mRNA levels. Allelic loss and imprinting from LIT1 mRNA contribute also to decreased p57KIP2 transcription. In vitro recapitulation of the in vivo findings, in A549 lung cells (p53/INK4A-B(-/-)), suggested that inhibition of the SKP2-degradation mechanism restores p57KIP2 expression and is adequate, in a INK4A-B(-/-) environment, to restrain growth. An additional demethylation step is required for complete expressional reconstitution of p57KIP2 in NSCLC.

Σκοπός: Η παρούσα έρευνα στοχεύει στην μελέτη της έκφρασης της p57KIP2 στη διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών ρύθμισής της και στη συσχέτισή της με τις κινητικές παραμέτρους στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Υλικό: Περιλαμβάνει 70 περιστατικά πρωτοπαθούς μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Οι in vivo παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν in vitro στην Α549 καρκινική κυτταρική σειρά του πνεύμονα με χρήση τεχνολογίας siRNA. Μέθοδοι: Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών p57KIP2, p27KIP1και SKP2 μελετήθηκαν με ανοσοϊστοχημεία, στύπωμα κατά Western και ανοσοφθορισμό. Οι κινητικές παράμετροι, πολλαπλασιασμός και απόπτωση εξετάστηκαν με ανοσοϊστοχημεία έναντι του Κi-67 και με τη μέθοδο TUNEL αντίστοιχα. Τα μεταγραφικά επίπεδα της p57KIP2 μελετήθηκαν με RT-PCR και επιβεβαιώθηκαν με Real Time PCR. H ανάλυση της μεθυλίωσης του υποκινητή της p57KIP2 και η μελέτη της απώλειας της ετεροζυγωτίας (LOH) της CDKN1C πραγματοποιήθηκαν με τις τεχνικές Pyrosequencing και τριχοειδική ηλεκτροφόρηση αντίστοιχα. Με τη χρήση τεχνολογίας siRNA πραγματοποιήθηκε η αποσιώπηση του γονιδίου SKP2 στην A549. Με την επίδραση του φαρμάκου 5’-αζακυτιδίνη έγινε απομεθυλίωση του υποκινητή CDKN1C στην A549. Αποτελέσματα: Παρατηρήθηκαν χαμηλά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών p57KIP2 και p27KIP1 στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και βρέθηκε ότι σχετίζονται ανάστροφα με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η πτώση των επιπέδων της p57KIP2 προκύπτει τόσο σε μεταγραφικό επίπεδο κυρίως λόγω της μεθυλίωσης του υποκινητή και απώλειας της ετεροζυγωτίας, όσο και σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο λόγω αύξησης των επιπέδων της πρωτεΐνης SKP2. In vitro αποσιώπηση της SKP2 στην κυτταρική σειρά Α549 (INK4A-B-/-), οδηγεί σε αύξηση των επιπέδων των p57KIP2 καθώς και της p27KIP1 με σύγχρονη μείωση του κυτταρικής αύξησης. Η απομεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου της p57KIP2 οδηγεί σε σημαντική αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων της p57KIP2 χωρίς ανάλογη αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης, ενώ η ταυτόχρονη αποσιώπηση της SKP2 αποκαθιστά τα επίπεδα της p57KIP2. Συμπεράσματα: Μελλοντικές θεραπευτικές προσεγγίσεις που θα στοχεύουν στην αποκατάσταση των επιπέδων των αναστολέων του κυτταρικού κύκλου θα πρέπει αφενός να αξιολογήσουν το μοριακό προφίλ του ασθενούς και αφετέρου να αξιολογήσουν τους υποκείμενους μηχανισμούς που ευθύνονται για την απορρύθμιση των επιπέδων τους.