Διερεύνηση των μεταβολών του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού θανάτου υπό την επίδραση κυτταροκινών

Abstract

The aim of the present thesis was to study the in vitro effect of inflammatory cytokines on the cell cycle and in particular on cell proliferation of the A549 and SKMES cell lines. Cytokines that are considered as key players in inflammatory conditions (IL-1β, TNF-α, IFN-γ and IL-13) were initially used in order to analyze their effect on cell proliferation at specific time points and concentrations. All of the studied cytokines seemed to cause a slowdown of the proliferation rate of both cell lines. The next step was to study the effect of whole human serum, as serum is evidently the source of this complicated and interactive network of cytokines in health and disease. Sarcoidosis and chronic obstructive pulmonary disease (COPD), were selected as representative systemic inflammatory diseases in which the lung is the target organ. Serum from healthy individuals and patients with lung cancer were also included in the study, which highlights the potential role of human serum as a research tool of significant biological value. The study revealed that only serum from patients with sarcoidosis had an effect, causing a considerable increase on cell proliferation. The results of the study also strengthened the results of a previews (pilot) study from our team, which used only serum from patients with sarcoidosis, with similar outcome. Sarcoidosis has been considered a possible partner of favorable predisposition in carcinogenesis in a number of epidemiological studies. The present study suggests a possible implication of the inflammatory environment of sarcoidosis (but not COPD) as a unique set up favorable to carcinogenesis. The study also suggests the implication of cytokines and mediators other than the cytokines analyzed in its first step. Since the cell lines used originate from lung epithelium and the sera used come from patients with lung diseases, Epithelial Growth Factor/EGF and more specifically its receptor / EGFR, was chosen as an eligible mediator to be tested on cell proliferation. The EGFR inhibitor cetuximab, is currently used in lung cancer treatment and was used to test the effect of EGFR on cell proliferation. This part of the study revealed that when the EGFR inhibitor was added to the cell culture medium simultaneously with serum from patients with sarcoidosis, it abolished the stimulatory effect of the latter on cell proliferation. The immunocytochemistry revealed increased expression of EGFR on cell membrane, cytoplasm and nucleus of the cells treated with serum from patients with sarcoidosis compared to the cells treated with EGFR inhibitor. In conclusion, the present study demonstrated a mild inhibitory effect of certain inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, IFN-γ and IL-13) on cell proliferation. It also showed the potential role of human serum as the source of all mediators. The use of serum from patients with inflammatory diseases of the lung results in different effects depending on the underline disease and not the inflammatory process per se. So Sarcoidosis, but not COPD, caused a considerable increase in cell proliferation mediated by EGF receptor. EGFR inhibitor abolishes the serum effect when added concomitantly to the cell culture medium. Our results showed that only Sarcoidosis and not other inflammatory lung diseases could create a microenvironment which is rather favorable for the cells to proliferate through the EGFR pathway. Under the “right” circumstances this specific inflammation of sarcoidosis could lead to malignant transformation and carcinogenesis.

Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της δράσης των κυτταροκινών στον κυτταρικό κύκλο και ειδικότερα στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Μελετήθηκε η μεταβολή του ρυθμού πολλαπλασιασμού δύο κυτταρικών σειρών (Α549 και SKMES) υπό την επίδραση διαφόρων μεσολαβητών της φλεγμονής. Στην πρώτη φάση της μελέτης χρησιμοποιήθηκαν αντιπροσωπευτικές κυτταροκίνες της φλεγμονής (IL-1β, TNF-α, IFN-γ και IL-13 των οποίων η δράση πάνω στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατεγράφη σε συγκεκριμένους χρόνους και συγκεκριμένες συγκεντρώσεις. Οι κυτταροκίνες που χρησιμοποιήθηκαν φάνηκε ότι προκαλούν επιβράδυνση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση ορού από ασθενείς με δύο από τα πιο αντιπροσωπευτικά συστηματικά φλεγμονώδη νοσήματα με όργανο στόχο το αναπνευστικό επιθήλιο, Σαρκοείδωση και Χρονία Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια, καθώς και ορός από ασθενείς με καρκίνωμα του πνεύμονα. Ο ορός επελέγη ως διαδραστικό υλικό της ερευνητικής μελέτης καθώς αποτελεί την πηγή του δικτύου των κυτταροκινών και μεταβολιτών που δρουν σε πραγματικές συνθήκες κατά την πορεία μίας νόσου. Η διερεύνηση αυτού του τύπου της δράσης των μεσολαβητών της φλεγμονής θεωρούμε ότι έχει σημαντική βιολογική αξία καθώς αντιπροσωπεύει πραγματικές συνθήκες και συγκεντρώσεις και καλύπτει το πολύπλοκο φάσμα κυτταροκινών που απαντάται in vivo. Από τους ορούς που μελετήθηκαν, μόνο ο ορός από ασθενείς με σαρκοείδωση επηρέασε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό προκαλώντας σημαντική αύξηση αυτού (επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα προγενέστερης αρχικής μελέτης που είχε γίνει στο εργαστήριό μας, με χρήση μόνο ορού από ασθενείς με σαρκοείδωση). Το γεγονός ότι η σαρκοείδωση έχει συνδεθεί με εμφάνιση νεοπλασίας, κάνει τα ευρήματα αυτά ακόμα πιο σημαντικά. Η μελέτη αυτή υποδεικνύει ότι πιθανόν να ενεργοποιούνται μηχανισμοί πέραν αυτών μίας συστηματικής φλεγμονώδους νόσου (η ΧΑΠ δεν έχει την ίδια δράση), με αποτέλεσμα την δημιουργία συνθηκών ευνοϊκών για την ανάπτυξη νεοπλασίας. Βάσει του σημαντικού αυτού αποτελέσματος, κρίθηκε μείζονος σημασίας η αναζήτηση του μονοπατιού μέσω του οποίου προκαλείται αυτή η αντίδραση των κυττάρων. Επειδή και οι δύο κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη είναι επιθηλιακού τύπου και παρατηρείται αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, θεωρήθηκε ότι θα έπρεπε να διερευνηθεί η συμμετοχή του κατ’εξοχήν υπεύθυνου μεσολαβητή, ως προς τον πολλαπλασιασμό τους, του αυξητικού παράγοντα των επιθηλιακών κυττάρων / Epithelial Growth Factor, και πιο συγκεκριμένα του υποδοχέα του EGF (Epithelial Growth Factor Receptor / EGFR). Για να μελετηθεί η συμμετοχή του EGFR, χρησιμοποιήθηκε ένας αναστολέας της ενεργοποίησής του (cetuximab). Ο αναστολέας που μελετήθηκε, χρησιμοποιείται στην θεραπεία του μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα. Η διερεύνηση αυτή έδειξε ότι ο αναστολέας, όταν χορηγηθεί ταυτόχρονα, ακυρώνει την ευοδωτική δράση του ορού από ασθενείς με Σαρκοείδωση, στον ρυθμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η ανοσοκυτταροχημική μελέτη του EGFR έδειξε πως τα κύτταρα των οποίων το θρεπτικό μέσο ήταν εμπλουτισμένο με ορό ασθενών με σαρκοείδωση, εκφράζουν τον υποδοχέα σε μεγαλύτερη έκταση και ένταση στην κυτταρική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα, σε σχέση με τα κύτταρα των οποίων το θρεπτικό μέσο είχε εμπλουτισθεί με τον αναστολέα. Με την παρούσα διατριβή υπογραμμίζεται η ποικίλη δράση των κυτταροκίνων στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Επιβεβαιώνονται ευρήματα της ομάδας μας για την ερευνητική αξία της χρήσης του ορού από ασθενείς με ποικίλα νοσήματα στην διερεύνηση της παθογένειας φλεγμονωδών νοσημάτων αλλά και νεοπλασιών. Και τελικώς υποδεικνύεται μία πιθανή σχέση του EGF και ειδικότερα του υποδοχέα του, (EGFR), σε παθογενετικές διεργασίες στο πλαίσιο της σαρκοείδωσης οι οποίες επιπλέον ενδεχομένως να εμπλέκονται σε καρκινογένεση μέσα στο ίδιο αυτό πλαίσιο της συγκεκριμένης συστηματικής φλεγμονώδους νόσου.