Μελέτη των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας του μεσοσπονδύλιου δίσκου της οσφυϊκής μοίρας της σπονδυλικής στήλης σε ασθενείς που χειρουργήθηκαν για κήλη μεσοσπονδύλιου δίσκου

Abstract

Low back pain is usually associated with abnormalities in the intervertebral discs of lumbar region, which is under continuous pressure and supports the weight of the entire body. Degeneration of the lumbar disc, biochemical changes and continuous loading lead to disc herniation, that appears on radiological investigation as protrusion, extrusion or sequestration. The imbalance in production and loss of proteoglycans is a significant alteration in the matrix of lumbar disc. The matrix molecules are disorganized due to enzymatic activity, leading to break down and loss of disc height and elasticity. Among these enzymes, matrix metalloproteinases (MMPs) have been identified in higher levels in the majority of degenerated discs and have been considered to be a possible initial event in disc alterations. In the present study we set out to investigate the expression of MMP-1, MMP-3 and MMP-9 and the histological alterations of intervertebral discs in patient’s operated on for lumbar disc herniation. Material and Methods For the purpose of the study 43 lumbar disc specimens were excised during surgery from 43 individuals, 28 males and 15 females (mean age 47 years old, range 21-76) with the diagnosis of lumbar disc herniation. Surgery was performed based on clinical signs, physical examination findings, MRI scan and patient’s decision. All patients suffered from low back pain and radiculopathy. The grade of herniation was categorized as protrusion (grade 1), extrusion (grade 2) and sequestration (grade 3), based on magnetic resonance imaging findings. The discs were originated from lumbar spine and specifically: 2 from (L1-L2), 2 from (L2-L3), 2 from (L3-L4), 14 from (L4-L5) and 23 from (L5-S1). Histologic Evaluation Histologic evaluation was performed on haematoxylin-eosin stained slides, using slightly modified previously reported grading systems. Briefly, the histologic changes were assessed separately on nucleus pulposus and annulus fibrosus, and a mean score was finally assigned. The grading system is based on four parameters, which represent distinct histologically recognizable alterations, i.e. chondrocyte proliferation/clusters (0=no proliferation, 1=increased cell density/connection of two chondrocytes, 2=small-medium size clones, 3=large size clones); tears and clefts (0=absent, 1=rarely present, 2=present in intermediate amounts, 3=abundantly present); granular changes (0=absent, 1=rarely present, 2=present in intermediate amounts, 3=abundantly present); and mucous degeneration (0=absent, 1=rarely present, 2=present in intermediate amounts, 3=abundantly present). The sum of the four parameters’ score was designated as histologic degeneration score (max=12). The histologic evaluation was performed separately by two pathologists, without knowledge of the clinical data. When disagreement arose, the slides were viewed in conference and a consensus was reached. Immunohistochemistry Immunostaining was performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections using the EnVision System and the antibodies: MMP-1, MMP-3 and MMP-9. Briefly, 4 μm-thick tissue sections were deparaffinized in xylene; rehydrated through graded concentrations of alcohol and heated in a microwave oven for 2 cycles of 15 minute each at 300W, in citrate buffer, for antigen retrieval. Endogenous peroxidase activity was blocked with H2O2 solution in methanol (0.01M), for 30 minutes. After washing with PBS for 5 minutes, the primary antibodies MMP-1, MMP-3 and MMP-9 were applied for incubation (30 minutes at room temperature). Then the slides were washed for 10 minutes with PBS and were visualized with the En Vision system using diaminobezidine tetrahydrochloride as a chromogen. Finally, all sections were counterstained with hematoxylin. As a negative control, the first antibody was substituted with normal mouse immunoglobulin of the same class. For statistical purposes the immunostaining was evaluated semiquantitavely, based on previous report, as follows: twenty high power fields were randomly selected from nucleus pulposus and twenty from annulus fibrosus, and the proportion of stained chondrocytes in relation to the total number of chondrocytes present in the field was calculated...

Η ΣΣ ως σύνολο εμφανίζει την ικανότητα να εκτελεί ένα ευρύ φάσμα κινήσεων, δυνατότητα που οφείλεται κυρίως στην δομή, την κατασκευή και τις εμβιομηχανικές ιδιότητες που διαθέτουν οι μεσοσπονδύλιοι δίσκοι (ΜΔ). Η ΟΜΣΣ υποβαστάζει το βάρος της κεφαλής , του κορμού και των άνω άκρων, οπότε η μείζονα φόρτιση καταγράφεται κυρίως στην συγκεκριμένη περιοχή. Η οσφυαλγία αποτελεί την δεύτερη πιο συχνή αιτία αναζήτησης ιατρικής βοήθειας και την πρώτη αιτία αποχής από την εργασία σε ηλικίες κάτω των 45 ετών. Οι δομικές διαταραχές που προκαλούν οσφυαλγία με/ή ισχιαλγία αφορούν κυρίως στους ΜΔ και περαιτέρω στην εμφάνιση δισκοκήλης. Οι αλλαγές στο ενδοδισκικό περιβάλλον και στον περιδισκικό χώρο αρχικά οδηγούν σε συμμετρική προβολή του ΜΔ και στην συνέχεια η εντοπισμένη μετακίνηση δισκικού υλικού πέρα από τα όρια του δισκικού χώρου δημιουργεί την δισκοκήλη. Η Μαγνητική Τομογραφία επέτρεψε την διάκριση των οσφυϊκών δισκοκηλών σε 3 βασικές μορφές: πρόπτωση, έκθλιψη και απόσπαση. Ο ΜΔ αποτελείται από δύο τμήματα, εξωτερικά τον ινώδη δακτύλιο (ΙΔ), με έσω και έξω τμήματα, και εσωτερικά τον πηκτοειδή πυρήνα (ΠΠ). Τα έσω και έξω τμήματα του ΙΔ συνδέονται με τις επιφυσιακές πλάκες και το σπονδυλικό σώμα αντίστοιχα. Νερό, πρωτεογλυκάνες και κολλαγόνο είναι κοινά συστατικά σε ΙΔ και ΠΠ αλλά σε διαφορετική αναλογία , άμεσα σχετιζόμενη με την λειτουργία κάθε τμήματος. Η εμφάνιση μιας οσφυϊκής δισκοκήλης αποτελεί ένα συνδυασμό μιας σειράς εμβιομηχανικών αλλαγών και μιας φλεγμονώδους αντίδρασης με δυσχέρεια διάκρισης αιτίου και συνέπειας μεταξύ των. Επηρεάζεται από μηχανικές φορτίσεις, περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως το κάπνισμα, γενετικούς παράγοντες, αυτοάνοσους μηχανισμούς και αλλαγές στην κυτταρική βιολογία του ΜΔ. Πρωτεογλυκάνες και ίνες κολλαγόνου στην θεμέλια ουσία του ΜΔ αποτελούν το υπόστρωμα για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs). Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι να προσδιορίσει τον βαθμό συσχέτισης των δομικών αλλαγών της θεμέλιας ουσίας του ΜΔ με την ηλικία και την μορφή της δισκοκήλης σε ασθενείς που, βάσει κλινικών και απεικονιστικών ευρημάτων, χειρουργήθηκαν για οσφυϊκή δισκοκήλη. Οι δομικές αυτές αλλαγές περιλαμβάνουν την μορφολογία του ΙΔ και των χονδροκυττάρων, τα είδη εκφύλισης της θεμέλιας ουσίας και την ανοσοέκφραση των μεταλλοπρωτεϊνασών. Για τον σκοπό της παρούσας μελέτης μελετήθηκαν τα δείγματα δισκοκήλης 43 ασθενών (28 άνδρες και 15 γυναίκες, μ.η.47 έτη, εύρος 21-76). Η διάγνωση σε όλους ήταν οσφυϊκή δισκοκήλη και η προεγχειρητική σημειολογία περιελάμβανε άλγος χωρίς πάρεση ρίζας ή ορθοκυστικές διαταραχές. Η χειρουργική θεραπεία επελέγη βάσει της κλινικής εικόνας, των ευρημάτων από την μαγνητική τομογραφία και της απόφασης του ασθενούς. Οι προσπελάσεις περιελάμβαναν μικροδισκεκτομή και πεταλεκτομία. Η κήλη του ΜΔ αφορούσε στα εξής διαστήματα: Ο1-Ο2 σε 2 ασθενείς, Ο2-Ο3 σε 2, Ο3-Ο4 σε 2, Ο4-Ο5 σε 14 και Ο5-Ι1 σε 23. Ακολούθησε κατηγοριοποίηση των μορφολογικών αλλαγών και ανοσοϊστοχημικός έλεγχος για κάθε παρασκεύασμα δισκοκήλης. Το σύστημα βαθμολόγησης βασίσθηκε σε 4 παραμέτρους και μελετήθηκαν οι MMPs 1, 3, 9. Στην παρούσα μελέτη διαπιστώσαμε ότι όλα τα δείγματα παρουσίασαν εκφυλιστικές αλλοιώσεις, που συσχετίστηκαν σημαντικά με τον βαθμό της δισκοκήλης και λιγότερο με την ηλικία. Η έκφραση των MMP-1 και MMP-3 συσχετίσθηκε με την αύξηση του βαθμού της δισκοκήλης, την αύξηση του βαθμού εκφυλισμού του ΜΔ βάσει HDS και με την ηλικία του ασθενoύς. Από την άλλη πλευρά η έκφραση της MMP-9 ήταν καθολικότερη σε κάθε δείγμα αλλά λιγότερο έντονη. Επίσης, η καταγραφή μιας συσχέτισης στην ανοσοέκφραση μεταξύ των ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 και λιγότερο με την ΜΜΡ-9 σε όλες τις ηλικίες θέτει νέα ερωτήματα για την χρονική ακολουθία έκφρασης των ενζύμων στην διαδικασία εκφύλισης και δημιουργίας της δισκοκήλης. Συμπερασματικά, η εμπλοκή τριών MMPs από τρείς διαφορετικές υποκατηγορίες στις ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις του ΜΔ αναδεικνύει τον πρωταρχικό ρόλο αυτής της κατηγορίας ενζύμων στην διαδικασία. Οι παρατηρήσεις αυτές όσον αφορά στην φλεγμονώδη ερμηνεία της δημιουργίας μιας δισκοκήλης συνιστούν μια σημαντική κατεύθυνση στην αναζήτηση των αρχικών σταδίων αυτής σε διάφορες ηλικίες.