Ανάλυση προσδεδμένων στο DNA πρωτεϊνών σε ασπόνδυλα (Ostrea edulis)

Abstract

The protein composition of the sperm nucleus of bivalve molluscs is a characteristic example of the variety of sperm-specific chromatin proteins, since these organisms contain a wide range of structurally different protein molecules, whose protein compositions are nevertheless surprisingly close. This thesis work was centred on the study of the sperm basic nuclear proteins of the bivalve O. edulis (edible oyster. Family: Ostreidae). The aim of this work is to contribute in accumulating more information which will allow us to obtain a better insight of the alternative mode of chromatin organization in this type of germ cells. Extraction of sperm proteins with hydrochloric acid and comparison to the chromatin proteins of somatic cells shows them to contain a full set of core histones (H2A, H2B, H3 and H4) together with three sperm-specific proteins, named OE1, OE2 and OE3. OE1 and OE2 differ slightly in their electrophoretic mobility and they move a little slower than calf thymus HI, whereas OE3 (which appears as a triplet) moves a little slower than H3. OE1 and OE2 have very similar amino acid compositions, characteristic of the HI family of proteins. Cyanogen bromide cleavage yields products of the same electrophoretic mobility and they both possess a trypsin-resistant core peptide with a molecular weight of ~ 8.5 kDa (the same as the molecular weight of the globular core of calf thymus HI). The above data put together indicate that OE1 and OE2 are closely homologous histone HI-like proteins. Western immunoblotting shows that OE1 and OE2 are closely related to the HI-like protein PL-II* of Mytilus trossulus. Based on these biochemical results the proteins OE1 and OE2 are classified in the PL-II group of sperm proteins from bivalve molluscs. On the other hand, the amino acid composition of OE3 shows it to be a protamine-like protein. Edman degradation of a cyanogen bromide peptide (P3) from OE2 gave the sequence MKAAFAKGLKSGALVRPKGS, which shares a striking degree of homology (85%) to a sequence located towards the C-terminal end of the globular domain of the PL-II* protein of M. trossulus. The latter is represented in291the sperm by two primary structure variants, which could be equivalent to the proteins OE1 and OE2 of O. edulis. At the molecular level, this work aimed at the isolation of the genes coding for OE1/2 and OE3, in order to obtain their complete amino acid sequences. A cDNA library was prepared starting with mRNA extracted from a mixture of ripe and immature male gonads of O. edulis. This library yielded two cDNA clones: one of 428 bp (clone col) and one of 306 bp (clone co2). They both comprised part of the ORF of the HI-like protein, however these incomplete sequences were sufficient to confirm the high degree of homology between the O. edulis and the M. trossulus proteins. In addition, these clones offered preliminary evidence for possible coding of OE3 in a common ORF with OE1/2. A 1018 bp genomic fragment including an ORF of 750 bp was isolated by PCR amplification from genomic sperm DNA. Hypothetical translation showed the ORF to encode OE1/2 immediately followed by OE3, separated by a proteolytic processing site. This arrangement is also found in two other bivalve species, M. trossulus and E. minor. The amino acid sequences at the junctions between the two proteins indicate a similar mechanism of proteolytic processing in O. edulis and M. trossulus, but a variant mechanism in E. minor. Comparison of the amino acid sequences of OE1/2 and OE3 to the relevant proteins of other bivalve molluscs reveals almost complete identity of OE1/2 to the PL-II* protein from M. trossulus, whereas OE3 seems to be more closely related to the S (protamine-like) proteins from two different oyster species, G. yessoensis and S. swifti. Based on the protein composition of its sperm nucleus, O. edulis is classified in the protamine-like group 0 of bivalve molluscs together with another oyster of the same family, C. gigas. Small but significant sequence differences between the cDNA clones, the genomic fragment and the P3 peptide make it clear that O. edulis contains at least three copies of this 2-protein ORF in its genome. The fact that this ORF is multicopy could be the explanation for the considerable microheterogeneity of OE3, which has already been electrophoretically demonstrated.292From the evolutionary point of view, O. edulis seems to belong to the more primitive group of bivalve molluscs, since its sperm chromatin consists mainly of histones together with a short protamine-like protein. Based on this protein composition one is justified to speculate that the sperm chromatin of O. edulis will be fairly similar to that of the somatic cells, with only minor differences.

Η πρωτεϊνική σύσταση του πυρήνα στο σπέρμα των δίθυρων μαλακίων αποτελεί ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα της ποικιλότητας των ειδικών για το σπέρμα χρωματινικών πρωτεϊνών, καθώς στους οργανισμούς αυτούς συναντάται ένα μεγάλο εύρος δομικά διαφορετικών πρωτεϊνικών μορίων, τα οποία όμως εμφανίζουν πολύ κοντινές αμινοξικές συστάσεις. Με στόχο, λοιπόν, τη συνεισφορά στη συγκέντρωση στοιχείων, που θα αποτελόσουν τη βάση για τη μελλοντική κατανόηση του εναλλακτικού τρόπου οργάνωσης της χρωματίνης σε αυτόν τον τύπο γαμετικών κυττάρων, η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στη μελέτη των σπερματικών, βασικών, πυρηνικών πρωτεϊνών ενός είδους δίθυρου, του Ostrea edulis (εδώδιμο στρείδι, Οικογένεια: Ostreidae). Η εκχύλιση των σπερματικών πρωτεϊνών με υδροχλωρικό οξύ και η σύγκρισή τους με τις χρωματινικές πρωτεΐνες των σωματικών κυττάρων έδειξε, ότι αυτές περιέχουν ένα πλήρες σύνολο κεντρικών ιστονών (Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4), μαζί με τρεις ειδικές για το σπέρμα πρωτεΐνες, που ονομάστηκαν ΟΕ1, ΟΕ2 και ΟΕ3. Οι ΟΕ1 και ΟΕ2 παρουσιάζουν πολύ μικρή διαφορά στην ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα και κινούνται λίγο αργότερα από την ιστόνη Η1 του θύμου μόσχου, ενώ η ΟΕ3 (η οποία εμφανίζεται ως τριπλέτα ζωνών) κινείται λίγο αργότερα από την ιστόνη Η3. Οι ΟΕ1 και ΟΕ2 έχουν πολύ κοντινές αμινοξικές συστάσεις, οι οποίες επιπλέον είναι χαρακτηριστικές πρωτεϊνικών μορίων, που ανήκουν στην οικογένεια της ιστόνης Η1. Η πέψη τους με βρωμιούχο κυάνιο δίνει προϊόντα ίδιας ηλεκτροφορητικής κινητικότητας και εμφανίζουν και οι δύο ένα ανθεκτικό στην πέψη με τρυψίνη πεπτίδιο με μοριακό βάρος ~ 8.5 kDa, αντίστοιχο δηλαδή του ανθεκτικού στην τρυψίνη πυρήνα της Η1 του θύμου μόσχου. Τα πιο πάνω στοιχεία συνδυασμένα, συναστούν ισχυρές ενδείξεις, ότι πρόκειται για πρωτεΐνες της Η1 οικογένειας με μεγάλη ομολογία μεταξύ τους. Η μεταφορά κατά Western και η επακόλουθη ανοσοεντόπιση έδειξαν, ότι οι ΟΕ1 και ΟΕ2 εμφανίζουν μεγάλη συγγένεια με την παρόμοια με την Η1 πρωτεΐνη PL-II* του Μ. trossulus. Με βάση τα βιοχημικά αυτά δεδομένα, οι πρωτεΐνες ΟΕ1 και ΟΕ2 κατατάσσονται στην κατηγορία PL-II των σπερματικών πρωτεϊνών των δίθυρων μαλακίων. Από την άλλη μεριά, η αμινοξική σύσταση της ΟΕ3 την κατατάσσει στις παρόμοιες με τις πρωταμίνες πρωτεΐνες.288Η αποικοδόμηση κατά Edman ενός πεπτιδίου (Ρ3), το οποίο προέκυψε από την πέψη με βρωμιούχο κυάνιο της ΟΕ2 έδωσε την αλληλουχία MKAAFAKGLKSGALVRPKGS, η οποία παρουσιάζει εντυπωσιακό βαθμό ομολογίας (85%) με κομμάτι του καρβοξυλικού άκρου του σφαιρικού πυρήνα της PL-II* πρωτεΐνης του Μ. trossulus. Η τελευταία εμφανίζεται στο σπέρμα με δύο παραλλαγές πρωτοταγούς δομής, οι οποίες ίσως μπορούν να παραλληλισθούν με τις δύο πρωτεΐνες OE 1 και ΟΕ2 του Ο. edulis. Στο μοριακό επίπεδο, στόχος ήταν ο εντοπισμός των γονιδίων των πρωτεϊνών ΟΕ1/2 και της ΟΕ3, ώστε να γίνει γνωστή η πλήρης αμινοξική αλληλουχία τους. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκε μια cDNA βιβλιοθήκη ξεκινώντας από mRNA ώριμου και άωρου σπέρματος Ο. edulis. Από τη βιβλιοθήκη απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν δύο cDNA μόρια μεγέθους 428 bp (κλώνος col) και 306 bp (κλώνος co2). Και οι δύο κλώνοι περιελάμβαναν τμήμα του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης της παρόμοιας με την Η1 πρωτεΐνης, όμως ακόμη και από αυτές τις μερικές αλληλουχίες επιβεβαιώθηκε η μεγάλη ομολογία της πρωτεΐνης του Ο. edulis με την αντίστοιχη του Μ. trossulus. Επίσης, οι κλώνοι αυτοί παρείχαν μία πρώτη ένδειξη για πιθανή κωδικοποίηση της ΟΕ3 σε κοινό ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης με την ΟΕ1/2. Ένα γενωμικό κομμάτι μήκους 1018 bp, το οποίο περιελάμβανε ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 750 bp, απομονώθηκε με PCR πολλαπλασιασμό από γενωμικό σπερματικό DNA. Η υποθετική μετάφραση αυτού του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης έδειξε, ότι κωδικοποιεί για την ΟΕ1/2 αμέσως ακολουθούμενη από την ΟΕ3, ενώ μεταξύ τους παρεμβάλλεται μία θέση πρωτεόλυσης. Η διευθέτηση αυτή συναντάται επίσης σε άλλα δύο είδη δίθυρων μαλακίων, τα Μ. trossulus και Ε. minor. Οι αμινοξικές αλληλουχίες στις συνδέσεις μεταξύ των δύο πρωτεϊνών είναι ενδεικτικές ενός παρόμοιου μηχανισμού πρωτεόλυσης στα Ο. edulis και Μ. trossulus, ενώ φαίνεται να διαφέρει κάπως στο Ε. minor. Η συγκριτική μελέτη της αμινοξικής αλληλουχίας των πρωτεϊνών ΟΕ1/2 και ΟΕ3 με αντίστοιχες πρωτεΐνες άλλων δίθυρων μαλακίων, αποκαλύπτει τη σχεδόν απόλυτη ταύτιση της ΟΕ1/2 με την PL-II* του Μ trossulus, ενώ η ΟΕ3 εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια με τις S πρωτεΐνες (πρωτεΐνες παρόμοιες με τις289πρωταμίνες) δύο άλλων ειδών στρειδιών, των G. yessoensis και S. swifti. Με βάση αυτήν την πρωτεϊνική σύσταση του σπερματικού πυρήνα, το Ο. edulis κατατάσσεται στην ομάδα 0 των δίθυρων μαλακίων, ομάδα στην οποία ανήκει και ένα άλλο στρείδι της ίδιας οικογένειας, το C. gigas. Οι μικρές αλλά σημαντικές διαφορές αλληλουχίας, που παρατηρούνται μεταξύ των cDNA κλώνων, του γενωμικού κομματιού και του Ρ3 πεπτιδίου αποκαλύπτουν την ύπαρξη αυτού του διπρωτεϊνικού ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης σε τρία τουλάχιστον αντίγραφα στο γονιδίωμα του Ο. edulis. Η πολυαντιγραφικότητα αυτή εξηγεί και τη μικροετερογένεια της ΟΕ3, η οποία είχε εκφραστεί ηλεκτροφορητικά. Η μικροετερογένεια των ειδικών για το σπέρμα πρωτεϊνών αποτελεί χαρακτηριστικό όλων των δίθυρων μαλακίων και επιβεβαιώνεται και στην περίπτωση του Ο. edulis. Εξελικτικά το Ο. edulis κατατάσσεται στην πιο πρωτόγονη ομάδα των δίθυρων, καθώς η σπερματική του χρωματίνη περιέχει κυρίως ιστόνες και μόνο μια μικρή, παρόμοια με τις πρωταμίνες πρωτεΐνη, γεγονός που μας επιτρέπει την πρόβλεψη, ότι η σπερματική του χρωματίνη θα εμφανίζει πολύ μικρές διαφορές από εκείνη των σωματικών κυττάρων.