Μελέτη της επίδρασης του βαλπροϊκού οξέος στην οργανογένεση και στην κυτταρική απόπτωση του οφθαλμού εμβρύου μυός Balb/C

Abstract

Valproic acid is a pharmaceutical substance used in a variety of neurologic and psychiatric type of diseases, with its main activity in controlling seizures of epilepsy. Its potential teratogenic effect makes its use dangerous for pregnant women, especially during the first trimester, when organogenesis is in procedure. Many studies have been conducted to determine the role of valproic acid in teratogenic embryonic expressions in diverse organs and systems in vivo as well as in cell cultures in vitro. Induction or even inhibition of apoptosis in a variety of cells, fetal or not, has been an ambiguous issue in the international literature, in which many contradictory results exist. The object of this study was to elucidate and determine the congenital anomalies provoked by valproic acid on the ocular tissues and cells of the fetus of Balb/C mice and to investigate whether apoptosis is implicated for those actions. The pharmaceutical substance was administered intraperitoneally during the seventh and tenth day of gestation, during which organogenesis is conducted at this race of mice. On one group of mice, valproic acid was given during the last days of gestation, namely on the sixteenth, seventeenth and eighteenth day. Histochemical study of the histological sections from the heads of the fetuses was conducted with Heindenhein’s Azan staining. This method of staining stains the nuclei red, the muscle tissue orange and the collagen dark blue. On the histological sections of the fetuses on which valproic acid acted during organogenesis, many ocular morphological anomalies where found, such as exophthalmos, incomplete growth of the lids, lack of collagen formation in the cornea and retinal evagination located in several loci. These anomalies where not found at the control groups and at the group on which valproic acid was administered at the end of gestation. With the use of this staining, many dark coloured nuclei where spotted and this comprises a characteristic feature of apoptotic cells. The immunohistochemical study was performed and identified with the use of Tunel staining, which identifies apoptotic cells. Specifically, Tunel staining stains the free hydroxylic ends of the genetic material that has been cleaved in many fractions. Tunel staining revealed the existence of a great amount of apoptotic cells at the eyes of the fetuses that were in vivo treated with valproic acid, regardless the timing that treatment happened. Further statistic analysis showed that a great statistically significant difference was found between the percentages of apoptotic cells of all ocular tissues of treated groups, compared to those of the control groups. In conclusion, valproic acid induces apoptosis at the cells of the developing eye of the fetus of Balb/C mice, regardless the time of the gestation this happens. Induction of apoptosis when organogenesis takes place, may play its own unique role, interfering with the cascade of events that occur during organogenesis, causing morphological anomalies, which are interpreted as minor or major, leading to the expression of ocular teratogenesis.

Το βαλπροϊκό οξύ είναι μία φαρμακευτική ουσία, που χρησιμοποιείται σε ποικίλες νευρολογικές και ψυχιατρικές καταστάσεις, με κύρια χρήση της την αντιμετώπιση της επιληψίας. Η εν δυνάμει τερατογόνος δράση της καθιστά τη χρήση της επικίνδυνη στις εγκύους, ιδιαίτερα στο πρώτο τρίμηνο της κύησης, οπότε και συντελείται η οργανογένεση του εμβρύου. Πολλές έρευνες έχουν διεξαχθεί για να προσδιοριστεί ο τρόπος δράσης του βαλπροϊκού οξέος και να εξηγηθεί η τερατογόνος δράση του. Η επαγωγή ή αντίθετα η αναστολή της απόπτωσης σε ποικίλες ομάδες κυττάρων, εμβρυϊκών ή μη, έχει υπάρξει εκτεταμένο αντικείμενο συζήτησης, με αντικρουόμενα σε πολλές περιπτώσεις αποτελέσματα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η καταγραφή των συγγενών ανωμαλιών που προκαλούνται από την επίδραση της εν λόγω ουσίας στους ιστούς και τα κύτταρα του οφθαλμού των εμβρύων μυών της φυλής Balb/C και η διερεύνηση εάν ενέχεται ο μηχανισμός της κυτταρικής απόπτωσης στην εμφάνιση αυτών των συγγενών ανωμαλιών. Η φαρμακευτική ουσία επέδρασε μέσω ενδοπεριτοναϊκής έγχυσης ανάμεσα στην έβδομη και δέκατη ημέρα της εγκυμοσύνης, κατά τις οποίες επιτελείται η οργανογένεση στους συγκεκριμένους μύες, ενώ σε μία ομάδα πειραματοζώων η ουσία επέδρασε στο τέλος της κύησης, και συγκεκριμένα στη δέκατη έκτη, δέκατη έβδομη και δέκατη όγδοη ημέρα της κύησης. Η ιστοχημική μελέτη των ιστολογικών τομών των εμβρύων έγινε με τη χρώση Azan κατά Heindenhein. Πρόκειται για ιστοχημική μέθοδο χρωματισμού κατά την οποία χρωματίζονται ερυθροί οι πυρήνες των κυττάρων, πορτοκαλόχροος ο μυϊκός ιστός και βαθύ κυανό το κολλαγόνο. Στις ιστολογικές τομές των εμβρύων που επέδρασε το βαλπροϊκό οξύ στη διάρκεια της οργανογένεσης βρέθηκαν μορφολογικές ανωμαλίες του οφθαλμού, όπως εξόφθαλμος, ατελής ανάπτυξη βλεφάρων, έλλειψη σχηματισμού κολλαγόνου στον κερατοειδή και κάποιες θέσεις εγκολεασμού του αμφιβληστροειδούς. Οι μορφολογικές αυτές βλάβες δεν υπήρχαν στις ομάδες ελέγχου και στην ομάδα που έλαβε το βαλπροϊκό οξύ στο τέλος της κύησης. Με τη χρώση αυτή επίσης, αποκαλύφθηκε η ύπαρξη πολλών βαθυχρωματικών πυρήνων, οι οποίοι αποτελούν χαρακτηριστικό γνώρισμα των αποπτωτικών κυττάρων. Η ανοσοϊστοχημική μελέτη που ακολούθησε διεκπεραιώθηκε με τη χρήση της χρώσης Tunel, με την οποία σημαίνονται τα αποπτωτικά κύτταρα, και πιο συγκεκριμένα οι ελεύθερες υδροξυλικές άκρες του τεμαχισμένου γενετικού υλικού τους. Η χρώση αυτή αποκάλυψε την ύπαρξη μεγάλου ποσοστού αποπτωτικών κυττάρων στους οφθαλμούς των εμβρύων όλων των ομάδων που έλαβαν βαλπροϊκό οξύ, ανεξαρτήτως του χρόνου που η ουσία επέδρασε. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε την ύπαρξη εξεσημασμένης στατιστικώς σημαντικής διαφοράς των ποσοστών των αποπτωτικών κυττάρων των επιμέρους ιστών του οφθαλμού των ομάδων αυτών σε σχέση με τους μάρτυρες. Συμπερασματικά, το βαλπροϊκό οξύ προκαλεί απόπτωση στα κύτταρα του αναπτυσσόμενου οφθαλμού εμβρύου μυός Balb/C, σε οποιαδήποτε χρονική στιγμή της κύησης και αν συμβεί αυτό. Η επαγωγή της απόπτωσης των κυττάρων στη φάση της οργανογένεσης μπορεί να παίζει το δικό της ιδιαίτερο ρόλο, διαταράσσοντας την αλληλουχία των γεγονότων που συμβαίνουν κατά την οργανογένεση, οδηγώντας σε διαμαρτίες, μείζονες ή ελάσσονες, οι οποίες οδηγούν στην εμφάνιση συγγενών ανωμαλιών του οφθαλμού, που εκφράζουν την τερατογόνο δράση του βαλπροϊκού οξέος στον αναπτυσσόμενο οφθαλμό.