Μελέτη του μεταβολισμού του παράγοντα ενεργοποίησης αιμοπεταλίων (PAF) σε ανθρώπινο νεφρό και της συμμετοχής του στην πρόκληση σπειραματονεφρίτιδας

Abstract

Platelet Activating Factor, PAF, a glyceryl-ether phospholipid, is one of the most potent mediators of the allergic and inflammatory reactions. It is biosynthesized by either the de novo biosynthesis of glyceryl ether lipids or by remodelling of membrane phospholipids. Degradation of PAF proceeds via cleavage of the acetyl group from the sn-2 position yielding the biologically inactive lyso-PAF. PAF is synthesized and catabolized by various renal cells and tissues and exerts a wide range of biological activities on kidney tissue suggesting a potential role for him during renal injury. The aim of this study was to identify whether cortex and medulla of human kidney contains the PAF biosynthetic activities of the rem AT and de novo AT as well as the degradative activity of AH. Cortex and medulla were obtained from nephrectomized patients with adenocarcinoma. The enzymatic activities were determined by chemical methods developed in our laboratory. Both acetyltransferase activities were detected in cortex and medulla and distributed among the membrane subcellular fractions. rem AT and de novo AT show optimal rates at pH values of 7,4-7,7 and 8,4, respectively. rem AT is inhibited by BSA at concentration over 0,5 mg/ml, it follows Michaelis-Menten kinetics with both its substrates, lyso-PAF and Acetyl-CoA, it prefers to act on substrates with an ether ether rather than ester bond at the sn-1 position and its activity depends on the availability of Ca2+ ions. Α -SH group is necessary for its activity. The enzyme is strongly inhibited by various detergents but we managed to solubilize 28% of it using glycerol as the detergent. De novo AT activity is independent of Ca2+ but it depends on the presence of -S-S- groups at its active center. It shows optimal rates at BSA concentration of 0,5 mg/ml. AAPA, which is the product of the de novo AT action, is rapidly hydrolyzed to alkylacetylglycerol by phosphohydrolases. The different biochemical characteristics of rem AT and de novo AT suggest that they are discrete enzymes. There is no statistical difference between the specific activities of rem AT/de novo AT of cortex and medulla. AH is distributed between cytosol and membranes. There is no difference between the biochemical properties of cytosolic and membranous forms of AH. Finally, a novel method for the homogenization of renal biopsies was developed in order to determine the activity of both rem AT and AH at the homogenate.

Ο Παράγοντας Ενεργοποίησης Αιμοπεταλίων, PAF είναι ένα γλυκεριναιθερικό φωσφολιποειδές και αποτελεί έναν από τους ισχυρότερους μεσολαβητές της αλλεργικής και φλεγμονώδους αντίδρασης. Η βιοσύνθεσή του μπορεί να γίνει, είτε με την de novo βιοσύνθεση των γλυκεριναιθέρων, είτε με την μετατροπή πρόδρομων μεμβρανικών φωσφολιποειδών μέσω της πορείας αναχηματισμού. H αποικοδόμηση του PAF ξεκινά με την υδρόλυση της ακετυλομάδας από την sn-2 θέση του γλυκερινικού σκελετού που οδηγεί στον ανενεργό λυσο-PAF. Η παραγωγή αλλά και η αποικοδόμηση PAF έχει παρατηρηθεί τόσο σε απομονωμένο νεφρικό ιστό όσο και σε νεφρικά κύτταρα πειραματόζωων. Ο παραγόμενος στο νεφρό PAF έχει πλήθος βιολογικών δράσεων και ενοχοποιείται ως ένας από τους μεσολαβητές της νεφρικής βλάβης. Σκοπός της εργασίας αυτής είναι η ταυτόχρονη αναζήτηση και μελέτη των βιοσυνθετικών ενζύμων του PAF, de novo AT και rem AT καθώς και του αποικοδομητικού του ενζύμου, PAF-AH σε ανθρώπινο νεφρικό ιστό (φλοιό και μυελό). Οι νεφρικοί ιστοί προήλθαν από νεφρεκτομηθέντες ασθενείς με νεοπλασματική νεφρική διεργασία και τα ένζυμα προσδιορίστηκαν με χημικές μεθόδους που αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο. Διαπιστώθηκε ενζυμική δραστικότητα rem AT και de novo AT τόσο σε φλοιό όσο και σε μυελό ανθρώπινου νεφρικού ιστού όπως πιστοποιήθηκε και από ανάλυση των προϊόντων των ενζυμικών δοκιμασιών. Οι rem AT και de novo AT είναι μεμβρανικά ένζυμα. To βέλτιστο pH δράσης της μικροσωμιακής rem AT είναι στην περιοχή 7,4-7,7, ενώ της de novo AT είναι 8,4. Η rem AT αναστέλλεται από συγκεντρώσεις BSA μεγαλύτερες των 0,5 mg/ml, ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten με υποστρώματα τον λυσο-PAF και το ακέτυλο-CoA, δείχνει εξειδίκευση για αιθερικά υποστρώματα, εξαρτάται από Ca2+,ενώ πειράματα με διάφορους αναστολείς έδειξαν ότι για την δράση της απαιτεί μια ή περισσότερες ομάδες -SH. Το ένζυμο αναστέλλεται ισχυρά από διάφορους γαλακτωματοποιητές αλλά επιτεύχθηκε μικρό ποσοστό διαλυτοποίησης του ενζύμου (28 %) με κατεργασία με γλυκερόλη. H de novo AT είναι ανεξάρτητη Ca2+, απαιτεί ομάδες -S-S- για την δράση της και δείχνει μέγιστη δραστικότητα σε συγκέντρωση BSA 0,5 mg/ml. To προϊόν της δράσης της, το ΑΑΡΑ, υδρολύεται ταχύτατα από φωσφοϋδρολάσες προς AAG. Τα παραπάνω βιοχημικά χαρακτηριστικά διαφοροποιούν τις δύο ενζυμικές δραστικότητες. Δεν φαίνεται να υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά στην ειδική δραστικότητα της rem AT/de novo AT φλοιού και μυελού. Η δραστικότητα της PAF-AH κατανέμεται στο κυτόπλασμα και τις μεμβράνες αλλά δεν φαίνεται να υπάρχει διαφορά στις ιδιότητες της μεμβρανικής και κυτοπλασματικής PAF-AH. Τέλος, αναπτύχθηκε μέθοδος ομογενοποίησης νεφρικών βιοψιών για τον προσδιορισμό της δραστικότητας rem AT και PAF-AH σε αυτές και προσδιορίστηκε η δραστικότητα των ενζύμων στις πρώτες βιοψίες.