Effects of hypothyroidism on programmed cell death in forebrain structures of the rat during development and in the adult

Abstract

This study aimed to evaluate the effect of hypothyroidism on cell survival in developing and adult rat forebrain structures in two experimental models of pharmacologically induced hypothyroidism; one with congenital and the other with acquired hypothyroidism. The selected brain areas for studying hypothyroidism were the striatum and the lateral septum. Congenital hypothyroidism was pharmacologically induced by giving dams methimazole in their drinking water from the 9th gestational day and afterwards until the neonatal rats were sacrificed. Acquired hypothyroidism was pharmacologically induced by 4.5 weeks of treatment with methimazole in their drinking water, from postnatal day 35 until sacrifice. We used the TUNEL method for the in situ labeling of DNA fragmentation in dying cells. In addition, we used immunohistochemistry to detect the expression of the reliable apoptotic marker active caspase-3 and GABA. Finally, we also used cresyl violet staining to determine the number of “live” cells in the striatum and the lateral septum of hypothyroid and normal animals. The results of the present study showed that, hypothyroidism induces apoptotic cell death in the rat forebrain structures during development and in the adult. The apoptotic cell death is mediated by the activation of active caspase-3. Congenital hypothyroidism also affects the number of “live” cells, reducing their normal density after birth in the two brain areas examined. On the contrary, acquired hypothyroidism increases the normal density of “live” cells in the above brain areas. Apoptotic neurons, which were never detected in normal adult animals, are present in almost all forebrain structures of adult hypothyroid animals. Our findings also revealed that the density of GABAergic cells in both groups of hypothyroid animals is significantly reduced (about 13.13%) compared to the density of normal control animals. The size of the striatum in adult animals with congenital hypothyroidism is also significantly reduced, compared to normal control animals. On the contrary, in animals with acquired hypothyroidism the corresponding size of the striatum was not affected. The results of the present study lead to the following conclusions: 1) congenital hypothyroidism augments apoptotic cell death in the developing striatum and lateral septum; 2) congenital hypothyroidism affects the number of “live” cells, through the reduction of their normal density after birth in the striatum and the lateral septum; 3) congenital and acquired hypothyroidism induce apoptotic cell death in the adult forebrain, wich never occurs in normal animals; 4) apoptotic cell death in the developing and adult forebrain is mediated by the activation of caspase-3; 5) congenital and acquired hypothyroidism affect the survival and phenotype of the GABAergic striatal neurons; 6) congenital hypothyroidism induces a significant shrinkage of the size of the striatum in the adult; 7) the duration of hypothyroidism (congenital or acquired) appears to differentially affect cell viability, with congenital having more profound effects.

Στην έρευνα αυτή μελετήθηκαν η επίδραση του νεογνικού και του επίκτητου υποθυρεοειδισμού στην απόπτωση των νευρικών κυττάρων στο νεοραβδωτό σώμα και στον έξω πυρήνας του διαφράγματος κατά την ανάπτυξη και σε ενήλικους επίμυες. Οι υποθυρεοειδικοί αναπτυσσόμενοι επίμυες προέρχονται από μητέρες στις οποίες χορηγήθηκε 0,025% w/v 1-μεθυλ-2-μερκαπτοϊμιδαζόλης (μεθιμαζόλη, ΜΜΙ) στο πόσιμο νερό ad libitum από την 9η μέρα της κύησης. Ο υποθυρεοειδισμός σε ενήλικα ζώα προκλήθηκε με χορήγηση σε επίμυες ηλικίας 35 ημερών της ίδιας ποσότητας ΜΜΙ στο πόσιμο νερό για 4,5 εβδομάδες. Για τη σήμανση των αποπτωτικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο της μεθόδου TUNEL. Ανιχνεύτηκε, επίσης, ανοσοϊστοχημικά η ενεργός κασπάση-3, δείκτης που σχετίζεται με το φαινόμενο της απόπτωσης. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση του υποθυρεοειδισμού στην επιβίωση των GABAεργικών νευρώνων του νεοραβδωτού σώματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο νεογνικός υποθυρεοειδισμός αύξησε την πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης στο νεοραβδωτό σώμα και στον έξω πυρήνα του διαφράγματος, σε σύγκριση με την αντίστοιχη πυκνότητα των αποπτωτικών κυττάρων στα φυσιολογικά ζώα. Απόπτωση, επίσης, παρατηρήθηκε στα ενήλικα υποθυρεοειδικά ζώα σε όλους σχεδόν τους πυρήνες του τελικού εγκεφάλου, εύρημα το οποίο ουδέποτε έχει παρατηρηθεί σε φυσιολογικά ενήλικα ζώα. Ο επίκτητος υποθυρεοειδισμός προκάλεσε επίσης αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο σε ενήλικα ζώα σε όλους σχεδόν τους πυρήνες του τελικού εγκεφάλου, αν και η πυκνότητα κατανομής των κυττάρων αυτών ήταν μικρότερη της πυκνότητας κατανομής των αποπτωτικών κυττάρων σε ενήλικα ζώα με νεογνικό υποθυρεοειδισμό. Η δράση του νεογνικού υποθυρεοειδισμού είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της πυκνότητας των «ζωντανών» κυττάρων στο νεοραβδωτό σώμα και στον έξω πυρήνα του διαφράγματος κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Επίσης, ο νεογνικός αλλά και ο επίκτητος υποθυρεοειδισμός μείωσαν την πυκνότητα των GABAεργικών κυττάρων του νεοραβδωτού σώματος σε ενήλικα ζώα σε σύγκριση με την πυκνότητα των ίδιων κυττάρων στα φυσιολογικά ζώα. Τέλος, ο νεογνικός υποθυρεοειδισμός είχε ως αποτέλεσμα τη συρρίκνωση του νεοραβδωτού σώματος στα ενήλικα ζώα. Αντιθέτως, παρόμοια δράση δεν παρατηρήθηκε σε ζώα με επίκτητο υποθυρεοειδισμό. Από την παρούσα μελέτη προκύπτουν τα εξής συμπεράσματα: 1) ο νεογνικός υποθυρεοειδισμός αύξησε τον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στο αναπτυσσόμενο νεοραβδωτό σώμα και στον έξω πυρήνα του διαφράγματος, 2) ο νεογνικός υποθυρεοειδισμός μείωσε τη φυσιολογική πυκνότητα των «ζωντανών» κυττάρων μετά τη γέννηση στο νεοραβδωτό σώμα και στον έξω πυρήνα του διαφράγματος, 3) ο νεογνικός και ο επίκτητος υποθυρεοειδισμός προκάλεσαν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στους πυρήνες του τελικού εγκέφαλου, ο οποίος ουδέποτε έχει παρατηρηθεί σε φυσιολογικά ζώα, 4) ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος στους πυρήνες του τελικού εγκέφαλου προκαλείται από την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 τόσο κατά την ανάπτυξη όσο και στα ενήλικα ζώα, 5) ο νεογνικός και ο επίκτητος υποθυρεοειδισμός επηρεάζουν την επιβίωση και τον φαινότυπο των GABAεργικών νευρώνων του νεοραβδωτού σώματος, 6) ο νεογνικός υποθυρεοειδισμός προκαλεί συρρίκνωση του μεγέθους του νεοραβδωτού σώματος σε ενήλικα ζώα, 7) η διάρκεια του υποθυρεοειδισμού (νεογνικός ή επίκτητος) φαίνεται να επηρεάζει με διαφορετικό τρόπο την επιβίωση των κυττάρων στο τελικό εγκέφαλο, με τον νεογνικό να προκαλεί επιδείνωση στο φαινόμενο του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου.