Περίληψη
Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η μελέτη των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών που συγκροτούν την hsp70 μηχανή σε μετασχηματισμένα και φυσιολογικά κύτταρα και ο προσδιορισμός της πρωτεΐνης-μέλους της μηχανής, η στρατολόγηση ή η απουσία της οποίας πυροδοτεί τη διαδικασία μετατροπής ενός φυσιολογικού κυττάρου σε μετασχηματισμένο. Για τη μελέτη του παραπάνω φαινομένου χρησιμοποιήθηκε το μεγάλο Τ αντιγόνο του DNA ογκογόνου ιού SV40, το οποίο είναι γνωστό ότι αφενός μεν είναι ικανό να επάγει κυτταρικό μετασχηματισμό, αφετέρου δε να προσδένεται ειδικά στο κύριο μέλος της μηχανής, δηλαδή την hsp70. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τόσο το wtLTAg όσο και το mutLTAg αλληλεπιδρούν, in vitro, με την dj2 και η αλληλεπίδραση αυτή είναι ανεξάρτητη από την παρουσία ΑΤΡ. Οι πρωτεΐνες παραμένουν συνδεδεμένες ακόμη και μετά την προσθήκη στην αντίδραση hsc70. Για τον λόγο αυτό συμπεραίνεται ότι εκτός από το σχηματισμό του συμπλόκου dj2/hsc70 (διμερές:μονομερές), η παρουσία του LTAg οδηγεί στη δημιουρ ...
Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η μελέτη των αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών που συγκροτούν την hsp70 μηχανή σε μετασχηματισμένα και φυσιολογικά κύτταρα και ο προσδιορισμός της πρωτεΐνης-μέλους της μηχανής, η στρατολόγηση ή η απουσία της οποίας πυροδοτεί τη διαδικασία μετατροπής ενός φυσιολογικού κυττάρου σε μετασχηματισμένο. Για τη μελέτη του παραπάνω φαινομένου χρησιμοποιήθηκε το μεγάλο Τ αντιγόνο του DNA ογκογόνου ιού SV40, το οποίο είναι γνωστό ότι αφενός μεν είναι ικανό να επάγει κυτταρικό μετασχηματισμό, αφετέρου δε να προσδένεται ειδικά στο κύριο μέλος της μηχανής, δηλαδή την hsp70. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι τόσο το wtLTAg όσο και το mutLTAg αλληλεπιδρούν, in vitro, με την dj2 και η αλληλεπίδραση αυτή είναι ανεξάρτητη από την παρουσία ΑΤΡ. Οι πρωτεΐνες παραμένουν συνδεδεμένες ακόμη και μετά την προσθήκη στην αντίδραση hsc70. Για τον λόγο αυτό συμπεραίνεται ότι εκτός από το σχηματισμό του συμπλόκου dj2/hsc70 (διμερές:μονομερές), η παρουσία του LTAg οδηγεί στη δημιουργία μιας νέας τριμερούς δομής που αποτελείται από μονομερείς μορφές των πρωτεϊνών LTAg, dj2 και hsc70 (LTAg/dj2/hsc70). Παράλληλα, παρατηρήθηκε ότι η παρουσία του LTAg αυξάνει την ικανότητα του συμπλόκου dj2/hsc70 να αναδιπλώνει χημικά αποδιαταγμένη λουσιφεράση, αντίθετα με τη μεταλλαγμένη μορφή του LTAg η οποία δεν είναι ικανή να επηρεάσει την ενεργότητα αυτή. Επίσης, παρατηρήσαμε ότι ο σχηματισμός του συμπλόκου LTAg/dj2/hsc70 εμφανίζει κυτταροειδικότητα, αφού ανιχνεύθηκε μόνο σε μη επιτρεπτικά κύτταρα και μόνο παρουσία ΑΤΡ. Επιβεβαιώσαμε ότι οι αλληλεπιδράσεις της BAG-l με την hsc70 πραγματοποιούνται μέσω της BAG περιοχής και είναι ανεξάρτητες από την παρουσία ΑΤΡ. Διαπιστώθηκε ότι ενώ καμία από τις BAG-l πρωτεΐνες δεν αλληλεπιδρά απευθείας με την dj2, η παρουσία της hsc70 μπορεί να καταλύσει το σχηματισμό ετεροτριμερών συμπλοκών BAG-l/hsc70/dj2 και ΒΑGΔΝ10/hsc70/dj2, ενισχύοντας την άποψη ότι πολλές από τις αλληλεπιδράσεις των BAG πρωτεϊνών κατευθύνονται από τις hsp70s. Παρατηρήσαμε ότι η παρουσία της BAG-l μειώνει την ενεργότητα αναδίπλωσης του συμπλόκου dj2/hsc70 και ότι στα επιτρεπτικά κύτταρα, μετασχηματισμένα και μη, δημιουργούνται τα ετεροτριμερή σύμπλοκα BAG-l/dj2/hsc70 και BAGΔN10/dj2/hsc70, ανεξάρτητα από την παρουσία ΑΤΡ. Αντίθετα στα μη επιτρεπτικά κύτταρα, απουσία ΑΤΡ, η μεταλλαγμένη μορφή ΒΑGΔΝ 10 αδυνατεί να δημιουργήσει ετεροτριμερές σύμπλοκο με την hsc70 και την dj2. Παράλληλα, το LTAg αλληλεπιδρά με τη μηχανή BAG-l/hsc70/dj2 και τη μεταλλαγμένη της μορφή BAGΔN10/hsc70/dj2 μόνο μετά την προσθήκη ΑΤΡ. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι η CHIP (δείκτης αποικοδόμησης) αλληλεπιδρά με το σύμπλοκο BAG-l/hsc70/dj2, μόνο απουσία ΑΤΡ και φαίνεται να ρυθμίζει επιλεκτικά την αποικοδόμηση υποστρωμάτων ανάλογα με την επιδεκτικότητα ή μη του κυττάρου.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The aim of this study was to investigate the molecular interactions of the proteins comprising the Hsp70 chaperone machine in transformed and immortalized cell lines. Further, we tried to identify the protein component of the aforementioned machine whose recruitment or removal can trigger cell transformation. To this end, we utilized the large T antigen of the DNA ongogenic virus SV40 that can induce cellular transformation and also interacts with hsc70, the main component of the hsp70 chaperone machine. Initially, we observed that both wtLTAg and mutLTAg could interact in vitro with dj2 in an ATP-independent manner. This interaction was retained even after the addition of hsp70. Upon presence of the LTAg we could detect two complexes: the previously documented dj2/hsc70 (dimmer:monomer) and a new trimeric complex (LTAg/dj2/hsc70). Furthermore, we noted that the presence of LTAg enhanced the activity of the dj2/hsc70 complex to refold chemical denatured luciferase whereas the mutated L ...
The aim of this study was to investigate the molecular interactions of the proteins comprising the Hsp70 chaperone machine in transformed and immortalized cell lines. Further, we tried to identify the protein component of the aforementioned machine whose recruitment or removal can trigger cell transformation. To this end, we utilized the large T antigen of the DNA ongogenic virus SV40 that can induce cellular transformation and also interacts with hsc70, the main component of the hsp70 chaperone machine. Initially, we observed that both wtLTAg and mutLTAg could interact in vitro with dj2 in an ATP-independent manner. This interaction was retained even after the addition of hsp70. Upon presence of the LTAg we could detect two complexes: the previously documented dj2/hsc70 (dimmer:monomer) and a new trimeric complex (LTAg/dj2/hsc70). Furthermore, we noted that the presence of LTAg enhanced the activity of the dj2/hsc70 complex to refold chemical denatured luciferase whereas the mutated LTAg had no such activity. We also observed that the formation of the LTAg/dj2/hsc70 complex is cell-type specific since it was detected only in non-permissive cells in an ATP-dependent manner. In addition, we confirmed that the BAG-l/hsc70 interactions were mediated through the C-terminus BAG domain in an ATP-independent manner. BAG-l/dj2 interactions were indirect and occurred via hsc70. The presence of BAG-l decreased the refolding activity of the hsc70/dj2 complex. In permissive cells the formation of BAG-l/dj2/hsc70 and BAGΔN10/dj2/hsc70 complexes was ATP independent. On the contrary, in non permissive cells in the absence of ATP, the mutated BAGΔN10 could not be detected in a trimeric complex with hsc70 and dj2. At the same time, LTAg interacted with BAG-l/hsc70/dj2 and BAGΔN10/hsc70/dj2 complexes only in the presence of ATP. Finally, we observed that CHIP (degradation marker) interacted with BAG-l/hsc70/dj2 complex in the absence of ATP, thus suggesting that CHIP might regulate the protein degradation selectively depending upon the permissiveness of the cell.
περισσότερα