Σύνθεση νέων αναστολέων φωσφολιπασών Α2 και μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης τους

Abstract

Phospholipases A2 comprise a family of lipolytic enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond of phospholipids, to release free fatty acids, including arachidonic acid, and lysophospholipids. The products of this enzymatic hydrolysis are converted to eicosanoids, prostaglandins and leukotrienes, which are considered to be potent mediators of inflammation. Therefore, reducing the formation of arachidonic acid, by inhibition of phospholipases A2, would be valuable for prevention and treatment of various inflammatory conditions, such as brain injury, allergic symptoms and other diseases and is an attractive target for the design of new anti-inflammatory drugs. In the first chapter of this thesis, we present the structure, function, and catalytic mechanism of cPLA2 and iPLA2. Both of these cytosolic phospholipases selectively cleave the sn-2 ester bond of phospholipids. Moreover, cPLA2 is an 85 kDa protein, and shows selectivity for arachidonic acid. iPLA2 is an 80-88 kDa protein, shows no selectivity for arachidonic acid and is calcium-independent. Most of the already known inhibitors of cPLA2 and iPLA2 and some representative methods of their synthesis are summarized in the second chapter. Among these inhibitors, several fattty acid derivatives, pyrrole and indole derivatives, 2-propanone derivatives, pyrrolidine derivatives, trifluoromethylketones, natural products and enol lactones are included. In the third chapter, we discuss the enzymatic removal of carboxyl-, amino- and hydroxyl-protecting groups. The synthesis of complex, polyfunctional organic molecules, such as oligonucleotides, oligosaccharides and in general natural products, requires the proper introduction and removal of protecting groups. For this purpose a large number of protecting groups as well as chemical methods for protection and deprotection of various functionalities have been developed and are widely used in synthetic organic chemistry. A major problem for the synthesis of polyfunctional molecules is that a given functional group has to be protected or deprotected selectively in the presence of functionalities of similar reactivity as well as functionalities sensitive to acids, bases, oxidation or reduction. The application of biocatalysts in the protecting group chemistry may offer excellent alternatives to chemical methods, because enzymes: (i) carry out highly chemo- and regioselective transformations, (ii) usually operate at neutral pH values, and (iii) combine a high selectivity for the reactions they catalyze and the structure they recognize with a broad substrate tolerance. The aim of this thesis was the synthesis and study of new bioactive molecules that could show inhibitory activity against cPLA2 and iPLA2. Furthermore, we were interested in finding an enzyme that could be used in organic synthesis for the selective removal of ester protecting groups, and its applicability in the synthesis of 2-oxoamide inhibitors. It has been demonstrated that the 2-oxoamide inhibitor based on δ-amino acid has shown the best in vitro inhibitory activity against cPLA2. Dipeptides are considered to be δ-amino acid analogues, because of the distance between N- and C-terminal groups. L-Valine and L-norleucine were used as starting materials to synthesize a series of derivatives that contain the activated 2-oxoamide group and an amide group as replacement of two methylenes of the δ-amino acid derivative. The 2-oxoamide group can be synthesized by coupling the amino group of the protected dipeptide with 2-hydroxy-acid, followed by oxidation. Dipeptides can be synthesized by coupling of suitably N-protected valine or norleucine with several hydrochloric salts of glycine esters. The final derivatives contain a free or a protected carboxyl group. In a similar manner, pseudodipeptides based on ethers, can be considered as δ-amino acid analogues. They can be formed by reduction of Boc- and Z-L-norleucine and reaction with bromoacetic acid esters. Removal of Boc- and Z-protecting group, followed by coupling with 2-hydroxy acid and oxidation, yielded 2-oxoamide derivatives, containing an ether bond instead of one methylene. .............................

Οι φωσφολιπάσες Α2 είναι ένζυμα που χαρακτηρίζονται από την ικανότητά τους να καταλύουν την υδρόλυση του μεσαίου εστερικού δεσμού (sn-2) φωσφολιπιδικών υποστρωμάτων, παράγοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα και λυσοφωσφολιπίδια. Τα προϊόντα αυτής της ενζυμικής υδρόλυσης αποτελούν πρόδρομες ενώσεις των εικοσανοειδών, τα οποία θεωρείται ότι εμπλέκονται ως διαμεσολαβητές σε πολλές παθολογικές καταστάσεις, όπως η φλεγμονή και ο πόνος, Επομένως, η σύνθεση ισχυρών και εκλεκτικών αναστολέων των φωσφολιπασών Α2 μπορεί να οδηγήσει σε νέα φάρμακα για την καταπολέμηση πολλών ασθενειών, όπως φλεγμονή, αλλεργικά συμπτώματα, βλάβες του εγκεφάλου, καρδιαγγειακές διαταραχές και καρκίνος. Στο πρώτο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής, παρουσιάζονται η δομή, η λειτουργία, η τοπολογία και ο μηχανισμός δράσης των φωσφολιπασών cPLA2 και iPLA2. Πρόκειται για δύο κυτοσολικές φωσφολιπάσες που εξειδικεύονται στην υδρόλυση του μεσαίου εστερικού δεσμού (sn-2) των φωσφολιπιδίων. Η cPLA2 είναι ένα ένζυμο με μοριακό βάρος 85 kDa, εμφανίζει εκλεκτικότητα για το αραχιδονικό οξύ και η κρυσταλλική της δομή έγινε γνωστή μόλις το 1999. Η iPLA2 έχει μοροακό βάρος 85-88 kDa, δεν εμφανίζει εκλεκτικότητα για συγκεκριμένο λιπαρό οξύ και είναι ανεξάρτητη ιόντων ασβεστίου. Στο δεύτερο κεφάλαιο, συνοψίζονται διάφορες κατηγορίες ενώσεων που δρουν ως αναστολείς των δύο παραπάνω ενζύμων και έχουν ανακοινωθεί στη βιβλιογραφία μέχρι σήμερα. Ανάμεσα σε αυτούς συμπεριλαμβάνονται παράγωγα λιπαρών οξέων, πυρρολίου και ινδολίου, πυρρολιδινών, 2-προπανόνης, τριφθορομεθυλοκετονών, ενολολακτονών, καθώς και φυσικά προϊόντα. Για κάποιες από αυτές τις ενώσεις αναφέρονται αντιπροσωπευτικές μέθοδοι σύνθεσης. Στο τρίτο κεφάλαιο αυτής της εργασίας, γίνεται λόγος για ενζυμική απομάκρυνση προστατευτικών ομάδων της αμινομάδας, του καρβοξυλίου και του υδροξυλίου. Στη συνθετική Οργανική Χημεία, μία από τις πιο σημαντικές διαδικασίες είναι η κατάλληλη εισαγωγή ή απομάκρυνση προστατευτικών ομάδων. Παρ’όλο που έχουν αναπτυχθεί πολυάριθμες χημικές μέθοδοι για το χειρισμό προστατευτικών ομάδων, υπάρχουν προβλήματα, ιδίως σε περιπτώσεις όπου μία συγκεκριμένη δραστική ομάδα πρέπει να προστατευτεί ή να αποπροστετευτεί εκλεκτικά κάτω από πολύ ήπιες συνθήκες και παρουσία άλλων ομάδων με παρόμοια δραστικότητα, καθώς επίσης και παρουσία ομάδων που είναι ευαίσθητες σε όξινο, αλκαλικό, οξειδωτικό ή αναγωγικό περιβάλλον. Εναλλακτικά, για το σκοπό αυτό, μπορούν να χρησιμοποιηθούν βιοκαταλύτες, προσφέροντας διάφορα πλεονεκτήματα, όπως υψηλή εκλεκτικότητα ως προς τα υποστρώματα και πολύ ήπιες συνθήκες αντίδρασης. Σκοπός της διατριβής ήταν η σύνθεση και η μελέτη νέων μορίων που εμφανίζουν ανασταλτική δράση έναντι της cPLA2 και της iPLA2. Επιπλέον, μας απασχόλησε η εύρεση ενός ενζύμου που να μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη συνθετική Οργανική Χημεία για την εκλεκτική απομάκρυνση εστέρων, καθώς και η εφαρμογή του στις αντιδράσεις σύνθεσης των αναστολέων. Έχει βρεθεί ότι το 2-οξοαμίδιο που βασίζεται στο δ-αμινοξύ εμφανίζει την ισχυρότερη in vitro ανασταλτική δράση. Τα διπεπτίδια, λόγω της απόστασης της Ν- και C-τελικών ομάδων, μπορεί να θεωρηθούν ανάλογα δ-αμινοξέων. Ξεκινώντας από πρώτη ύλη L-βαλίνη, L-νορλευκίνη και γλυκίνη, παρασκευάστηκε μία σειρά ενώσεων που περιέχουν τη δραστική 2-οξοαμιδική ομάδα και φέρουν αμιδικό δεσμό σε αντικατάσταση δύο μεθυλενίων που παραγώγου δ-αμινοξέος. Η 2-οξοαμιδική ομάδα μπορεί να προκύψει από σύζευξη της αμινομάδας κατάλληλα προστατευμένου διπεπτιδίου, με 2-υδροξυ-δεκαεξανοϊκό οξύ ακολουθούμενη από οξείδωση. Τα διπεπτίδια προέρχονται από τη σύζευξη κατάλληλα Ν-προστατευμένης L-βαλίνης και L-νορλευκίνης με διάφορους εστέρες υδροχλωρικών αλάτων της γλυκίνης. Το καρβοξύλιο της τελικής ένωσης μπορεί να βρίσκεται ελεύθερο ή με τη μορφή εστέρα. Με παρόμοια λογική, και τα αιθερικού τύπου ψευδοδιπεπτίδια μπορούν να θεωρηθούν ανάλογα δ-αμινοξέων. .........................