Αξιολόγηση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) στη διάγνωση της φυματίωσης

Abstract

Tuberculosis (TB) continues to be a major health problem worldwide. Early diagnosis and prompt initiation of treatment, play important role in interrupting transmission of tubercle bacilli and in improving disease outcome. Isolation and identification of M. tuberculosis by conventional methods is problematic and requires 4 to 8 weeks. Recently, significant progress has been made in diagnosing tuberculosis by molecular biologic techniques. The aim of the present study was to evaluate the sensitivity and specificity of Polymerase Chain Reaction (PCR), in the diagnosis of different forms of tuberculosis.A total of 3180 clinical specimens; 472 sputum, 193 bronchoalveolar lavage (BAL), 851 cerebrospinal fluid, 765 gastric fluid, 512 pleural fluid, 74 pericardial fluid, 104 abscess fluid, 189 urine, and 20 bone biopsies were collected prospectively and examined by PCR (Amplicor MTB), cultures on Lowenstein-Jensen agar and for presence of acid fast bacilli on direct smears. Clinical data for each patient had been collected on a standardized form. Patients were divided in three categories: Definite cases of tuberculosis were considered those with positive culture for M. tuberculosis, probable cases those with negative culture, but clinical features, laboratory, and radiographic findings compatible with TB, and the remaining patients without any clinical or laboratory evidence for TB were regarded to have no tuberculosis.M. tuberculosis DNA was detected in 32 of 34 bactreriologically confirmed (sensitivity 94,1%) and in 8 of 10 probable cases of pulmonary tuberculosis (sensitivity 80%), whereas only 12 of 631 with no tuberculosis yielded a PCR product corresponding to M. tuberculosis (specificity 98,1%). M. tuberculosis DNA was detected in 39 of 44 bactreriologically confirmed (sensitivity 88,6%) and in 14 of 17 probable cases of tuberculous meningitis (sensitivity 82,4%), whereas only 23 of 807 CSF samples from patients with no tuberculosis yielded a PCR product (specificity 98,1%). None of the CSF samples from patients with meningitis of known etiologies other than tuberculous (microbial,viral, etc., n= 'fx) yielded a positive result by PCR. In gastric aspirate specimens, M. tuberculosis DNA was detected in 27 of 29 bactreriologically confirmed (sensitivity 93,1%) and in 8 of 11 probable cases of tuberculosis (sensitivity 72,8%), whereas only 12 of 736 gastric aspirates from patients with no tuberculosis yielded a PCR product (specificity 98,4%). In the remaining specimens (pleural fluid, pericardial fluid, abscess fluid, urine, osseous biopsy specimen) M. tuberculosis DNA was detected in 36 of 52 bactreriologically confirmed (sensitivity 69,2%) and in 14 of 18 probable cases of tuberculosis (sensitivity 77,8%), whereas only 40 of 847 with no tuberculosis yielded a PCR product corresponding to M. tuberculosis (specificity 95,2%). The sensitivity of PCR was higher in smear positive than in smear negative samples. PCR results were available within 6,5 hours at a reasonable cost (70 € per sample).The findings support that Amplicor PCR MTB is a useful test with high sensitivity and specificity for rapid diagnosis of different forms of tuberculosis.

Η φυματίωση εξακολουθεί να αποτελεί σοβαρό πρόβλημα υγείας παγκοσμίως. Η έγκαιρη διάγνωση και αντιμετώπιση της νόσου, είναι σημαντικά για τη μείωση της μετάδοσης του μυκοβακτηριδίου και τηΥκαλή έκβαση της νόσου. Οι συμβατικές μέθοδοι απομόνωσης και ταυτοποίησης του Μ, tuberculosis παρουσιάζουν μειονεκτήματα, όπως χαμηλή ευαισθησία ή απαιτούν 4-8 εβδομάδες για την ολοκλήρωσή τους. Τα τελευταία χρόνια, έχει γίνει σημαντική πρόοδος στη διάγνωση της φυματίωσης με τη χρήση μοριακών τεχνικών. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν, η εφαρμογή και αξιολόγηση της μεθόδου PCR για τη έγκαιρη διάγνωση διαφόρων κλινικών μορφών φυματίωσης.Συλλέχθηκαν 3457 δείγματα βιολογικών υλικών από ασθενείς με κλινική υποψία φυματίωσης και αξιολογήθηκαν 3180: 472 πτύελα, 193 βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (BAL), 851 εγκεφαλονωτιαίο υγρό, 765 γαστρικό υγρό, 512 πλευριτικό υγρό, 74 περικαρδιακό υγρό, 104 πύο, 189 ούρα, 20 οστικό υλικό τα οποία εξετάστηκαν με PCR (Amplicor PCR MTB), χρώση για οξεάντοχα βακτήρια (Ziehl-Neelsen) και καλλιέργεια σε Lowenstein- Jensen. Επίσης, καταγράφηκαν κλινικά στοιχεία για τους ασθενείς από τους οποίους προέρχονταν τα δείγματα. Επιβεβαιωμένες περιπτώσεις φυματίωσης θεωρήθηκαν εκείνες που είχαν θετική καλλιέργεια για Μ.tuberculosis, πιθανές περιπτώσεις εκείνες με αρνητική καλλιέργεια, αλλά κλινική εικόνα, ακτινολογικά ευρήματα και λοιπό εργαστηριακό έλεγχο συμβατά με τη νόσο, Mantoux θετική, και ανταπόκριση στην αντιφυματική αγωγή, ενώ ότι δεν έπασχαν από φυματίωση οι ασθενείς, όταν η καλλιέργεια για Μ. tuberculosis ήταν αρνητική και δεν παρουσίαζαν κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα συμβατά με τη νόσο.Στα δείγματα πτυέλων και BAL, η PCR ανίχνευσε Μ. tuberculosis DNA σε 32 από τις 34 (ευαισθησία 94,1%) επιβεβαιωμένες περιπτώσεις και σε 8 από τις 10 (ευαισθησία 80%) πιθανές περιπτώσεις πνευμονικής φυματίωσης, ενώ η PCR ήταν θετική σε 12 από 631 (ειδικότητα-" 98,1%) δείγματα από ασθενείς χωρίς επιβεβαιωμένη φυματίωση. Στα δείγματα ΕΝΥ, η PCR ήταν θετική σε 39 από τις 44 (ευαισθησία 88,6%) επιβεβαιωμένες περιπτώσεις και σε 14 από τις 17 (ευαισθησία 82,4%) πιθανές περιπτώσεις φυματιώδους μηνιγγίτιδας, ενώ η PCR ήταν θετική σε 23 από 807 (ειδικότητα 98,1%) δείγματα από ασθενείς χωρίς φυματίωση. Η PCR ήταν αρνητική σε όλα τα δείγματα ΕΝΥ (π=9%) από ασθενείς με μηνιγγίτιδα γνωστής αιτιολογίας εκτός φυματιώδους (μικροβιακή, ιογενή κ.τ.λ.,). Σε δείγματα από γαστρικό υγρό, η PCR ανίχνευσε μυκοβακτηριδιακό DNA σε 27 από 29 (ευαισθησία 93,1%) ασθενείς με επιβεβαιωμένη και σε 8 από 11 (ευαισθησία 72,8%), ασθενείς με πιθανή φυματίωση, ενώ η PCR ήταν θετική σε 12 από 736 (ειδικότητα 98,4%) δείγματα από ασθενείς χωρίς επιβεβαιωμένη φυματίωση. Από τα υπόλοιπα δείγματα (πλευριτικό υγρό, περικαρδιακό υγρό, πύο, ούρα, οστικό υλικό) Μ. tuberculosis DNA ανιχνεύθηκε σε 36 από 52 (ευαισθησία 69,2%) επιβεβαιωμένες και σε 14 από 18 (ευαισθησία 77,8%), πιθανές περιπτώσεις φυματίωσης, ενώ η PCR ήταν θετική σε 40 από 847 (ειδικότητα 95,2%) ασθενείς χωρίς επιβεβαιωμένη φυματίωση. Η ευαισθησία της PCR ήταν υψηλότερη στα δείγματα με θετική άμεση χρώση για οξεάντοχα βακτήρια. Η ολοκλήρωση της PCR απαιτεί 6.5 ώρες και το κόστος ανά δείγμα περίπου 70 €.Τα ευρήματα μας υποστηρίζουν ότι η PCR- Amplicor MTB αποτελεί αξιόπιστη μέθοδο, με υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, για την ταχεία διάγνωση διαφόρων μορφών φυματίωσης.