Ενεργότητα της paf - ακετυλοϋδρολάσης σε ασθενείς με διαταραχές του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών πριν και μετά τη χορήγηση υπολιπιδαιμικών φαρμάκων

Abstract

PAF-AH is a calcium independent phospholipase A2 that circulates in complex with lipoprotein particles. In human plasma, more than 90% of enzymatic activity is associated with low density lipoproteins (LDL) and the remainder with high density lipoproteins (HDL). Thus, the term plasma PAF-AH mainly reflects the LDL-associated proportion of the enzyme. Except for PAF, the enzyme can also effectively hydrolyze oxidized phospholipids with short acyl chains at sn-2 position. These phospholipids are formed during the oxidative modification of LDL and possibly contribute to their proinflammatory properties. From a pathophysiological point of view, PAF-AH may play either an antiatherogenic role (since it degrades PAF and oxidized phospholipids) or a proatherogenic role (since it generates lyso-PC and oxidized fatty acids, molecules that have been reported to exert several proinflammatory properties). The clinical studies that evaluated the role of PAF-AH in the pathogenesis of atherosclerosis failed to reveal consistent results. Thus, other studies have shown that patients with cardiovascular disease exhibit significantly higher plasma enzymatic activity as compared to healthy individuals, whereas recent studies in Japanese patients concluded that the loss of plasma enzymatic activity due to G994—»T mutation is a risk factor for ischemic events. However, a recent analysis of WOSCOPS data revealed that plasma PAF-AH is an independent risk factor for the development of cardiovascular disease. On the other hand, the HDL-associated proportion of the enzyme clearly plays an antiatherogenic role, since it protects LDL from oxidation and diminishes the biological action of oxidized LDL. The aim of this study was to determine and compare the PAF-AH activities in patients with different forms of primary dyslipidemias and to evaluate the effects of hypolipidemic drugs on plasma and HDL-associated enzymatic activity. Two hundred and seventy-five unrelated patients attending the outpatient Lipid Clinic of the University Hospital of Ioannina were screened. Secondary causes of dyslipidemia were excluded by history, clinical examination and appropriate laboratory tests. All patients instructed to follow a low fat-low cholesterol diet for at least 3 months. At the end of this period, all patients with abnormal lipid levels were included in the study. According to their baseline lipid values patients were subdivided into primary hypercholesterolemia or dyslipidemia type ILA group, consisted of 141 patients, combined hyperlipidemia or dyslipidemia type IIB group, of 84 patients, and hypertriglyceridemia or dyslipidemia type IV group of 50 patients. Furthermore, patients with138primary hypercholesterolemia were divided according to the underlying genetic defect into patients with homozygous familial hypercholesterolemia (HomoFH, n=5), patients with heterozygous familial hypercholesterolemia (HeteroFH, n=38), and patients with polygenic non-familial hypercholesterolemia (NonFH, n=98). Seventy-six patients received atorvastatin (55 type IIA and 21 type IIB patients), whereas 71 patients received fenofibrate (18 patients with type IIA dyslipidemia, 23 patients with type IIB dyslipidemia and 30 patients with type IV dyslipidemia). Serum lipid parameters and enzymatic activities were determined at baseline as well as after 16 weeks of active treatment. PAF-AH was measured in total plasma (for the determination of plasma PAF-AH), in HDL isolated after the precipitation ofapoB containing lipoproteins (for the determination ofHDL-associated PAF-AH) and in lipoprotein subtractions obtained by density gradient ultracentrifugation. All patient groups exhibited significantly higher plasma PAF-AH activity as compared to normolipidemic controls. In addition, patients with type IIA and type IIB dyslipidemia exhibited higher enzymatic activity as compared to type IV patients. Both type IIB and IV patients had significantly lower HDL-associated PAF-AH activity as compared to either type IIA or control group. In contrast, type IIA patients exhibited similar HDL-associated enzymatic activity with control individuals. Finally, all patient groups had significantly lower ratios of HDL-associated PAF-AH to LDL-cholesterol compared with control individuals. Subfractionation of apoB-containing lipoproteins revealed that in all study groups the greater proportion of PAF-AH activity was preferentially associated with small, dense LDL subtractions. Type IIA and IIB patients exhibited significantly higher enzymatic activity in all LDL subtractions as compared to type IV patients and control individuals. Additionally, type IIB and IV patients had higher enzymatic activities in VLDL+IDL subtractions as compared to control group. Among HDL subspecies PAF-AH was preferentially associated with dense HDL subffactions in all patient groups. Patients with type IIB and type IV dyslipidemias had significantly lower enzymatic activity in this subtraction as compared to controls, whereas type IIA patients had similar values with normolipidemic individuals. Finally, no differences were observed in PAF-AH activity associated with the other HDL subtractions among study groups. In all patient groups with primary hypercholesterolemia (type ILA dyslipidemia) the plasma PAF-AH activity was significantly elevated compared to controls, the HomoFH having the highest and the NonFH patients the lowest enzyme activity. Gradient ultracentrifugation studies showed that this increase was not only due to the elevation in the plasma LDL-cholesterol, but also to the increase in the PAF-AH specific activity in each LDL subtraction, being more139profound in the small-dense LDL-5. Unlike LDL, no difference in HDL-associated PAF-AH activity (expressed per mL of plasma) was observed among all groups. Consequently, an altered distribution of enzymatic activity among apo B- and apo AI-containing lipoproteins was observed in hypercholesterolemic patients, resulting in a significant decrease in the ratio of the HDL-associated PAF-AH to the total plasma enzyme activity compared to controls. This reduction is proportional to the increase of the plasma LDL-cholesterol levels and consequently to the severity of the hypercholesterolemia, being more profound in HomoFH patients. Atorvastatin and fenofibrate administration induced a significant reduction in plasma PAF-AH activity in all groups studied. However, the responsible mechanism for this reduction was different for each drug and was affected by the underlying defect in the lipoproteins metabolism. Specifically, atorvastatin induced a significant decrease in the enzymatic activity asssociated with all LDL subtractions in type IIA and type IIB patients. In contrast, fenofibrate administration resulted in a significant reduction in PAF-AH activity associated with small, dense LDL subtractions in all patient groups without affecting the enzymatic activity in large and intermediate density subfractions. The reduction in plasma PAF-AH activity in type IV patients after fenofibrate administration was mainly due to the reduction in enzymatic activity associated with VLDL+IDL subfractions. This phenomenon was also observed (although to a lesser extent) in type IIB patients. Although atorvastatin did not significantly affect HDL-associated PAF-AH activity in type IIA and type IIB patients, fenofibrate induced an increase in HDL-associated enzymatic activity in type IIB and IV patients, whereas it did not affect the enzymatic activity in type IIA patients. This increase was due to an elevation in enzymatic activity associated with dense HDL subfractions whereas the enzymatic activity in the other HDL subspecies was not significantly affected. Finally, fenofibrate and atorvastatin induced a significant increase in the ratio of HDL-associated PAF-AH to LDL-cholesterol in all patient groups. In conclusion patients with different forms of primary dyslipidemias exhibit significantly higher plasma PAF-AH activity as compared to healthy population. In addition, patients with type IIB and type IV dyslipidemia have lower HDL-associated enzymatic activity as compared to controls, whereas all patient groups possess diminished protective potency of HDL against the LDL proatherogenic properties. These alterations may contribute to the increased incidence of cardiovascular disease in patients with primary dyslipidemias. The reductions in plasma PAF-AH activity in all patient groups after atorvastatin and fenofibrate administration as well as the fenofibrate-induced increase in HDL-associated PAF-AH activity in patients with type140IIB and type IV dyslipidemia represent new additional mechanisms of action of these potent hypolipidemic drugs and may contribute to their antiatherogenic and antiinflammatory functions.

Η ακετυλοϋδρολάση του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF-AH) είναι μια φωσφολιπάση Α2 που κυκλοφορεί στο πλάσμα συνδεδεμένη με τα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια. Στο ανθρώπινο πλάσμα το μεγαλύτερο ποσοστό της ενζυμικής ενεργότητας (>90%) συνδέεται με τα σωματίδια των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν απολιποπρωτεΐνη Β, ενώ ένα μικρό ποσοστό της ενζυμικής ενεργότητας βρίσκεται συνδεδεμένο με τις λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL). Έτσι, ο όρος PAF-AH του πλάσματος χρησιμοποιείται κατά κύριο λόγο για να περιγράψει την ενζυμική ενεργότητα που βρίσκεται στις λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής (VLDL), ενδιάμεσης (IDL) και χαμηλής πυκνότητας (LDL). Από παθοφυσιολογική άποψη η PAF-AH του πλάσματος μπορεί είτε να διαδραματίζει αντιαθηρογόνο ρόλο δεδομένου ότι υδρολύει τον παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF), καθώς και τα οξειδωμένα φωσφολιπίδια με βραχεία αλυσίδα στη θέση 2 του σκελετού της γλυκερόλης. Αυτά τα φωσφολιπίδια σχηματίζονται κατά την οξείδωση των φωσφολιπιδίων των λιποπρωτεϊνών και των κυτταρικών μεμβρανών, δρούν διαμέσου του υποδοχέα του PAF και διαθέτουν πολυάριθμες ιδιότητες που προάγουν τη φλεγμονή του αγγειακού τοιχώματος. Ωστόσο, η PAF-AH του πλάσματος μπορεί να ευοδώνει την αθηρωματική διαδικασία δεδομένου ότι οδηγεί στο σχηματισμό λυσοφωσφατιδυλοχολίνης και οξειδωμένων λιπαρών οξέων, δηλαδή μορίων που ενδέχεται να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της αθηρωμάτωσης. Παρόμοια σύγχυση προέκυψε και από τα αποτελέσματα των κλινικών μελετών που εξέτασαν το ρόλο του ενζύμου του πλάσματος στην παθογένεια της αθηρωμάτωσης. Έτσι, κάποιες μελέτες έδειξαν ότι οι ασθενείς με καρδιαγγειακή νόσο έχουν αυξημένα επίπεδα του ενζύμου σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες, ενώ άλλες μελέτες στον Ιαπωνικό πληθυσμό έδειξαν ότι η εξάλλειψη της ενζυμικής ενεργότητας του πλάσματος αποτελεί προδιαθεσικό παράγοντα για την εμφάνιση καρδιαγγειακών συμβαμάτων. Ωστόσο, η πρόσφατη ανάλυση των αποτελεσμάτων της μελέτης WOSCOPS έδειξε ότι η μάζα της PAF-AH του πλάσματος αποτελεί ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την εμφάνιση καρδιαγειακής νόσου. Σε αντίθεση με το ένζυμο του πλάσματος, η PAF-AH των HDL διαδραματίζει σαφώς αντιαθηρογόνο ρόλο δεδομένου ότι προστατεύει τις LDL από την οξείδωση και μειώνει τη βιολογική δραστικότητα των ήδη οξειδωμένων HDL. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η εκτίμηση και σύγκριση των ενεργοτήτων της PAF-AH σε ασθενείς με διάφορες μορφές πρωτοπαθούς δυσλιπιδαιμίας, καθώς και η μελέτη της επίδρασης των υπολιπιδαιμικών φαρμάκων στις ενεργότητες του ενζύμου.134Στη μελέτη συμμετείχαν συνολικά 275 ασθενείς με πρωτοπαθή δυσλιπιδαιμία, οι οποίοι παρακολουθούνταν στο Εξωτερικό Ιατρείο Λιπιδίων του Περιφερειακού Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ιωαννίνων. Η στρατολόγηση και ένταξη τους στη μελέτη διήρκεσε περίπου 3 έτη. Όλοι οι ασθενείς τέθηκαν σε δίαιτα χαμηλή σε λίπος και χοληστερόλη για τουλάχιστον 3 μήνες. Μετά από αυτό το χρονικό διάστημα όσοι ασθενείς εξακολούθησαν να έχουν αυξημένα επίπεδα λιπιδίων εντάχθηκαν στη μελέτη. Ανάλογα με τα επίπεδα των λιπιδίων οι ασθενείς χωρίστηκαν σε 3 ομάδες: την ομάδα των ασθενών με πρωτοπαθή υπερχοληστερολαιμία ή δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ (η=141), την ομάδα των ασθενών με μικτή δυσλιπιδαιμία ή δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΒ (η=84) και την ομάδα των ασθενών με πρωτοπαθή υπερτριγλυκεριδαιμία ή δυσλιπιδαιμία τύπου IV (η=50). Επιπρόσθετα, οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ χωρίστηκαν περαιτέρω ανάλογα με το είδος της υποκείμενης γενετικής διαταραχής του μεταβολισμού των λιπιδίων σε ασθενείς με ομόζυγη οικογενή υπερχοληστερολαιμία (η=5), ασθενείς με ετερόζυγη οικογενή υπερχοληστερολαιμία (η=38) και ασθενείς με πολυγονική, μη οικογενή υπερχοληστερολαιμία (η=98). Από τους ασθενείς της μελέτης 76 έλαβαν ατορβαστατίνη (55 με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ και 21 με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΒ) και 71 φενοφιβράτη (18 με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ, 23 με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΒ και 30 με δυσλιπιδαιμία τύπου IV). Τα επίπεδα των λιπιδίων και απολιποπρωτεϊνών, καθώς και οι ενζυμικές ενεργότητες του πλάσματος, των HDL και των λιποπρωτεϊνικών υποκλασμάτων προσδιορίστηκαν πριν την έναρξη της αγωγής, καθώς και μετά από 16 εβδομάδες θεραπείας. Εκατόν πενήντα υγιείς εθελοντές με φυσιολογικά επίπεδα λιπιδίων του πλάσματος αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Όλες οι ομάδες των ασθενών εμφάνισαν σημαντικά υψηλότερη ενεργότητα της PAF-AH του πλάσματος σε σύγκριση με τους υγιείς εθελοντές. Επιπρόσθετα, οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμίες τύπου ΙΙΑ και ΙΙΒ εμφάνισαν υψηλότερη ενεργότητα σε σύγκριση με τους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου IV. Οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ εμφάνισαν παρόμοια ενεργότητα της PAF-AH των HDL σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμίες τύπου ΙΙΒ και IV εμφάνισαν χαμηλότερη ενεργότητα σε σύγκριση τόσο με την ομάδα ελέγχου, όσο και με την ομάδα των ασθενών με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ. Τέλος, οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου IV εμφάνισαν χαμηλότερη ενζυμική ενεργότητα στις HDL συγκριτικά με τους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΒ. Όλες οι ομάδες των δυσλιπιδαιμικών ασθενών παρουσίασαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές του λόγου της PAF-AH των HDL προς την LDL χοληστερόλη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στις τιμές αυτού του λόγου μεταξύ των ομάδων των ασθενών. Η ανάλυση των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν απολιποπρωτεΐνη Β στα επιμέρους υποκλάσματά τους έδειξε ότι135το μεγαλύτερο ποσοστό της ενζυμικής ενεργότητας συσχετίζονταν με τα μικρά, πυκνά LDL υποκλάσματα σε όλες τις ομάδες των ασθενών. Οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμίες τύπου ΙΙΑ και ΙΙΒ είχαν υψηλότερη ενεργότητα της PAF-AH σε όλα τα υποκλάσματα των LDL σε σύγκριση με την ομάδα των ασθενών με δυσλιπιδαιμία τύπου IV και την ομάδα ελέγχου, οι οποίες δεν διέφεραν μεταξύ τους οσον αφορά την ενεργότητα αυτών των υποκλασμάτων. Επιπρόσθετα, οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμίες τύπου ΙΙΒ και IV εμφάνισαν υψηλότερη ενεργότητα στα υποκλάσματα VLDL+IDL σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ο διαχωρισμός των HDL στα επιμέρους υποκλάσματά τους έδειξε ότι σε όλες τις ομάδες των ασθενών η PAF-AH συσχετίζονταν εκλεκτικά με το υποκλάσμα HDL-3c. Οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμίες τύπου ΙΙΒ και IV εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερη ενζυμική ενεργότητα σε αυτό το υποκλάσμα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και την ομάδα των ασθενών με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ, οι οποίες δεν διέφεραν μεταξύ τους. Τέλος, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στην ενεργότητα των υπόλοιπων υποκλασμάτων των HDL μεταξύ των ομάδων των ασθενών. Όταν οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ χωρίσθηκαν ανάλογα με τον τύπο της υποκείμενης γενετικής διαταραχής προέκυψε ότι οι ασθενείς με οικογενή υπερχοληστερολαιμία εμφανίζουν υψηλότερη ενεργότητα της PAF-AH του πλάσματος σε σύγκριση με τους ασθενείς με πολυγονική υπερχοληστερολαιμία. Επιπρόσθετα, οι ομοζυγότες εμφάνισαν υψηλότερη ενεργότητα στο πλάσμα σε σύγκριση με τους ετεροζυγότες. Η ανάλυση των LDL στα επιμέρους υποκλάσματά της έδειξε ότι οι διαφορές αυτές οφείλονταν σε αντίστοιχες διαφορές στην ενεργότητα όλων των υποκλασμάτων. Σε αντίθεση με την PAF-AH του πλάσματος οι ασθενείς με διάφορες μορφές πρωτοπαθούς υπερχοληστερολαιμίας δεν εμφάνισαν διαφορές στην ενζυμική ενεργότητα των HDL. Κατά συνέπεια, ο λόγος του ενζύμου των HDL προς το ένζυμο του πλάσματος, ο οποίος αποτελεί ένα δείκτη της κατανομής του ενζύμου μεταξύ των σωματιδίων που περιέχουν απολιποπρωτεΐνη Β και των HDL ήταν σημαντικά μικρότερος σε όλες τις ομάδες των ασθενών σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου και αυτή η μείωση ήταν συνάρτηση της βαρύτητας της υπερχοληστερολαιμίας. Τόσο η χορήγηση της ατορβαστατίνης, όσο και η χορήγηση της φενοφιβράτης οδήγησαν σε σημαντική μείωση της ενεργότητας της PAF-AH του πλάσματος σε όλες τις ομάδες των δυσλιπιδαιμικών ασθενών. Ωστόσο, ο υπεύθυνος μηχανισμός διέφερε ανάλογα με το φάρμακο και το είδος της υποκείμενης διαταραχής του μεταβολισμού των λιπιδίων. Έτσι, η ατορβαστατίνη προκάλεσε σημαντική μείωση της PAF-AH σε όλα τα υποκλάσματα των LDL στους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ και ΙΙΒ. Αντίθετα, η χορήγηση της φενοφιβράτης προκάλεσε σημαντική μείωση της ενζυμικής ενεργότητας μόνο στα μικρά, πυκνά υποκλάσματα136των LDL σε όλες τις ομάδες των ασθενών. Επιπρόσθετα, ο πιο σημαντικός μηχανισμός της μείωσης της PAF-AH του πλάσματος στους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου IV ήταν η μείωση της ενζυμικής ενεργότητας στα υποκλάσματα VLDL+IDL, φαινόμενο που παρατηρήθηκε (σε μικρότερο βαθμό) στους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΗΒ. Αν και η ατορβαστατίνη δεν επηρέασε σημαντικά την ενζυμική ενεργότητα των HDL σε καμία από τις ομάδες της μελέτης, η χορήγηση της φενοφιβράτης συνοδεύονταν από αύξηση της PAF- AH των HDL στους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΒ και IV. Αυτή η αύξηση οφείλονταν σε αντίστοιχη αύξηση της ενεργότητας του υποκλάσματος HDL-3c, ενώ η ενζυμική ενεργότητα των υπόλοιπων υποκλασμάτων της HDL δεν μεταβλήθηκε σημαντικά μετά τη χορήγηση του φαρμάκου. Τέλος, η φενοφιβράτη δεν επηρέασε της ενεργότητα της PAF-AH των HDL στους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΑ. Η χορήγηση τόσο της ατορβαστατίνης, όσο και της φενοφιβράτης συνοδεύονταν από αύξηση του λόγου της PAF-AH των HDL προς την LDL χοληστερόλη σε όλες τις ομάδες των ασθενών. Συμπερασματικά, όλες οι ομάδες των δυσλιπιδαιμικών ασθενών εμφανίζουν σημαντικά υψηλότερη ενεγότητα της PAF-AH στο πλάσμα σε σύγκριση με τον υγιή πληθυσμό. Επιπρόσθετα, οι ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΒ και IV εμφανίζουν χαμηλότερη ενεργότητα του ενζύμου στις HDL σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ενώ όλες οι ομάδες των ασθενών εμφανίζουν μείωση της ικανότητας της PAF-AH των HDL να προστατεύει από τις αθηρογόνες ιδιότητες των LDL σωματιδίων. Αυτά τα φαινόμενα ενδεχόμενα συμβάλλουν στην αυξημένη επίπτωση της καρδιαγγειακής νόσου που παρατηρείται στους ασθενείς με πρωτοπαθείς δυσλιπιδαιμίες. Η μείωση της PAF-AH του πλάσματος μετά τη χορήγηση ατορβαστατίνης και φενοφιβράτης, καθώς και η ικανότητα της φενοφιβράτης να αυξάνει την PAF-AH των HDL στους ασθενείς με δυσλιπιδαιμία τύπου ΙΙΒ και IV αποτελούν νέες πλειοτροπικές δράσεις διαμέσου των οποίων αυτές οι ομάδες των υπολιπιδαιμικών φαρμάκων επιβραδύνουν την εξέλιξη της αθηρωματικής νόσου και μειώνουν σημαντικά την καρδιαγγειακή νοσηρότητα και θνητότητα.