Παραγωγή heat shock 70 πρωτεΐνης (hsp 70) στα πολυμορφοπύρηνα σηπτικών νεογνών

Abstract

Sepsis is one of the most common clinical syndromes among neonates admitted to the intensive care units. Despite more aggressive approaches to early diagnosis and the use of newer antibiotics and novel biotherapies, mortality rates remain elevated in almost all published series. This suggests that a better understanding of the pathogenesis of sepsis, as well as of the mechanisms implicated in this disorder, is required to establish more effective therapeutic tools. Heat shock proteins (Hsps) constitute a complex, broadly widespread and overarching basic cellular defense mechanism against numerous stresses. They are highly conserved in prokaryotes and eukaryotes cells. These proteins function as molecular chaperones to protect cells from environmental stress damage by binding to partially denatured proteins, dissociating protein aggregates, and regulating the correct folding and intracellular translocation of newly synthesized polypeptides. The exact mechanism through which stress provokes the induction of hsps has not yet been completely explored. Hsps are subdivided into five families, according to their molecular mass. So they are differentiated into families of 27, 40, 60, 70, 90 and 110 KDa. The most important hsp and best characterized, in the humans, is the hsp70. Hsps confer an advantage to the host. Recent reports have shown that the induction of hsp70 reduces the mortality rates from sepsis in several animal models. A very limited number of existing studies concern the induction of hsps in the human cells, all of which regard adults. The expression of hsp70 in human monocytes-macrophages under normal and after stressful circumstances has been identified. Human lymphocytes express hsp70 only under stressful situations. On the other hand human PMN produce hsp70 under normal conditions while under stress increase the hsp70 production. Recently an increase in expression of hsp70 in granulocytes of critically ill patients has been described as well as in monocytes and PMN of septic patients. To the best of our knowledge there is no relevant work concerning the expression of hsp70 in neonatal cells during sepsis. We recently have shown that PMN of healthy neonates displayed an increase of hsp70 after exposure to heat shock. In this study we examined the induction of hsp70 of neonates in sepsis. It is known that the PMN during sepsis play important role in host defense by way of their ability to release oxygen free radicals and many chemical mediators. It is also known that these mediators can have toxic effects not only on tissue cells but also on the PMN themselves. The induction of hsp70 in septic neonates, as a natural intracellular defense mechanism can contribute to the maintenance of PMN function that is their capacity to eliminate the invading microorganisms. The goal of this study was to examine and determine quantitatively: a) the spontaneous expression of hsp70 in PMN of neonates suffering from gram(-) sepsis. b) the induction of hsp70 in PMN of healthy neonates after incubation with LPS, FMLP, LPS and FMLP and to compare the hsp70 production between neonatal and adult PMN after an identical condition. Our interest in LPS, FMLP stems from the fact that they derive from Gram(-) bacteria which are known to be largely responsible for neonatal sepsis. c) the induction of hsp70 in PMN of healthy neonates and adults exposed to heat shock and to compare any difference between neonatal and adult PMNs. Hsp70 expression was detected by immunoblotting and was measured quantitatively by Densitometer. The results were analysed with Mann-Whitney test and Wilcoxon Signed Rank test according to indications. The comparison of the hsp70 induction in the PMN between three neonate groups was based on Kruskal-Wallis method. More specifically in this work the synthesis of hsp70 was measured in the following categories: 1) In PMN samples from 11 septic neonates, 12 hours after the diagnosis. We found that the PMN of these neonates express high levels of hsp70. The mean value of hsp70 was 2,04μγ/1500000 PMN (SD 1,54) while the mean value of PMN of healthy neonates, used as controls, was 0,53μγ/1500000 PMN (SD 0,36) p < 0,05. This shows that neonatal PMN possess the hsps protective mechanism during sepsis. 2) In PMN samples froml2 healthy neonates and 12 adults who had been incubated with LPS in vitro (10ng/ml for 4,5 h). We found that neonatal PMN as well as adult incubated with LPS did not induce a significant increase in the amount of hsp70 in comparison to the amount produced by controls (healthy neonates and adults not exposed to LPS). p > 0,05. The mean value of hsp70 of neonatal PMN was 0,53μγ/1500000 PMN (SD 0,24) [mean value of controls amounts to 0,51μγ/1500000 PMN, (SD 0,24)] and that of adult PMN was 0,39μγ/1500000 PMN (SD 0,11) [mean value of hsp70 of controls 0,33 μγ/1500000 PMN, (SD 0,18)]. We believe that the inability of PMN to increase the hsp70 production in vitro results from the fact that LPS only primes PMN activation when subsequently exposed to an agonist, e.g. formylpeptides. 3) In PMN samples from 12 healthy neonates and 12 adults incubated with FMLP (1μΜ for 4,5 h). On the adults PMN group, a significant increase in hsp70 levels was found in comparison with the one identified in healthy adult PMN not exposed to FMLP (controls), p < 0,05. The mean value of adult PMN stimulated with FMLP was 0,44μγ/1500000 PMN (SD 0,22) [mean value of hsp70 in controls was 0,33μγ/1500000 PMN (SD 0,18)]. The neonatal PMN stimulated with FMLP did not display an increase in the expression of hsp70 in comparison to healthy neonatal PMN who were not exposed to FMLP (controls), p > 0,05. The mean value of hsp70 of healthy neonates activated with FMLP was 0,60μγ/1500000 PMN (SD 0,22) [mean value of hsp70 in controls 0,51μγ/1500000 PMN (SD 0,24)]. These findings suggest that hsp70 production in neonatal PMN after activation with FMLP is inferior to hsp70 production in adult PMN after FMLP activation. This is compatible with the known decreased chemotaxis of neonatal PMN to formylpeptides. 4) In PMN samples of 12 healthy neonates and 12 adults primed firstly with LPS (10ng/ml for 1h) and after activated with FMLP (1μΜ for 3,5h). The mean value of hsp70 in neonatal PMN was 0,66 μγ/1500000 PMN (SD 0,42) [the mean value of controls, that is healthy neonatal PMN not exposed to LPS and FMLP, was 0,51μγ/1500000 PMN (SD 0,24)] while the mean value of hsp70 in adults PMN was 0,54μγ/1500000 PMN (SD 0,23) [mean value of hsp70 of controls, that is healthy adults not exposed to LPS and then FMLP was 0,33 μγ/1500000 PMN (SD 0,18)]. It was found that neonatal PMN as well as adult PMN exposed to LPS and then to FMLP in vitro, displayed a significant increase in hsp70 production, p < 0,05 for neonates and p < 0,01 for adults. No important difference was identified between the hsp70 levels produced by neonatal PMN stimulated with LPS and then FMLP and the hsp70 levels produced by adult PMN under the same condition, p > 0,05. 5) In PMN samples from 11 healthy neonates and 11 healthy adults exposed to heat shock in vitro (42°C for 1h). It was seen that neonatal and adult PMN showed an increase of hsp70 production, p < 0.01 for neonates and p = 0,012 for adults. No difference was found between neonatal and adult PMN to produce hsp after exposure to heat shock. The mean value of hsp70 in neonatal PMN exposed to heat shock was 1,02μγ/1500000 PMN (SD 0,36) while the mean value of hsp70 in neonatal PMN remained at 37°C was 0,53μγ/1500000 PMN (SD 0,36)] and the mean value of hsp70 in adult PMN was 0,57μγ/1500000 PMN (SD 0,42) while the mean value of hsp70 in adult PMN not exposed to heat shock, controls, was 0,35μγ/1500000 PMN (SD 0,22). 6) By comparing the hsp70 levels of the three groups of neonates we found that the production of hsp70 in PMN of septic neonates is substantially greater than that observed in neonatal PMN exposed to heat shock in vitro or those who were incubated with LPS and then FMLP. p < 0.01. This may be related to the fact that inflammatory response is complex and that many other factors are involved in the production of hsps (apart from LPS, FMLP and hyperthermia). Our study shows that neonatal PMN express spontaneously high levels of hsp70 during sepsis, a fact confirmed in vitro where hsp70 production was found in neonatal PMN after the LPS and FMLP effect. It appears however that despite the fact, that PMN do possess the defense mechanism of heat shock proteins they are insufficient to provide protection against sepsis. Although we do not believe that hsps are the universal retort to injury, the increasing knowledge of the mechanisms of heat shock expression regulation and protection may help us to develop the appropriate strategy for the use of this natural defense mechanism in sepsis.

Η σηψαιμία είναι από τα συχνότερα κλινικά σύνδρομα στα νεογνά που νοσηλεύονται στις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας. Παρά τις επιθετικότερες προσεγγίσεις που έχουν εφαρμοσθεί τα τελευταία χρόνια όσον αφορά στην πρώιμη διάγνωση και στη χρήση νεώτερων αντιβιοτικών και καινούριων βιοθεραπειών, οι δείκτες θνητότητας δεν έχουν ουσιαστικά μεταβληθεί την τελευταία δεκαετία. Είναι ευνόητο ότι για να αναπτυχθούν περισσότερο αποτελεσματικά θεραπευτικά "εργαλεία" απαιτείται μεγαλύτερη και σε βάθος κατανόηση της παθογένειας της σήψης και των μηχανισμών που εμπλέκονται στην διαταραχή αυτή. Οι hsps αποτελούν ένα σύνθετο, ευρέως διαδεδομένο και κυρίαρχο βασικό μηχανισμό άμυνας του κυττάρου ενάντια σε πολυάριθμα stress όπως ο πυρετός, το τραύμα και η φλεγμονή. Είναι φυλογενετικά ο παλαιότερος διαπιστωμένος μηχανισμός κυτταρικής άμυνας και υπάρχει ουσιαστικά σε κάθε οργανισμό στον οποίο έχει ερευνηθεί. Οι hsps αποτελούν σημαντικό ποσοστό της ενδοκυττάριας δεξαμενής πρωτεϊνών. Σε φυσιολογικές συνθήκες, στο "ήρεμο κύτταρο" αποτελούν το 2% των κυτταρικών πρωτεϊνών, ενώ στο κύτταρο που έχει υποστεί κάποιου είδους stress φθάνουν μέχρι και 20% της ενδοκυττάριας δεξαμενής πρωτεϊνών. Οι hsps επιτελούν σημαντικές για το κύτταρο και ποικίλες λειτουργίες. Το χαρακτηριστικό τους γνώρισμα που τις διαχωρίζει από τις άλλες πρωτεΐνες είναι ότι η έκφρασή τους αυξάνεται σημαντικά σε απάντηση σε ένα ενδοκυττάριο stress αντίθετα από τις άλλες πρωτεΐνες των οποίων η έκφραση αναστέλλεται κατά το stress. Αν και αρχικά περιγράφηκαν ως απάντηση του κυττάρου ενάντια στο θερμικό stress, βρέθηκε στη συνέχεια ότι πολλά stress και κυρίως το οξειδωτικό (Η2Ο2, ιονισμένη ακτινοβολία, κ.ά.) καθώς και ορισμένοι φαρμακολογικοί παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν την παραγωγή hsps. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο το stress προκαλεί την παραγωγή hsp δεν έχει διευκρινισθεί πλήρως. Εντούτοις έχει βρεθεί ότι ένα από τα αρχικά βήματα στην ενδοκυττάρια μετάδοση του σήματος είναι η ενεργοποίηση του heat shock factor (hsf), μιας πρωτεΐνης που βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, η οποία όταν ενεργοποιηθεί, κατά τη διάρκεια του stress, συνδέεται με το heat shock element (hse), έναν υποκινητή μεταγραφής γονιδίων, ο οποίος στη συνέχεια διεγείρει ειδικά γονίδια να συνθέσουν hsps. Οι hsps ταξινομούνται ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Η ταξινόμηση αυτή δεν είναι αυθαίρετη διότι οι λειτουργίες τους τείνουν να διαφοροποιούνται ανάλογα με το μέγεθος τους. Έτσι η hsp27, μια μικρού μοριακού βάρους hsp, παίζει σημαντικό ρόλο στην αυξημένη θερμοαντοχή, οι hsp70 και hsp60 έχουν ειδικούς ρόλους ως "πρωτεΐνες επιδιορθωτές" (molecular chaperons) που βοηθούν στην "επιδιόρθωση" των μετουσιωμένων πρωτεϊνών στα κύτταρα, ενώ η hsp90 συνδέεται με τον υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών και ρυθμίζει τη λειτουργία των γλυκοκορτικοειδών στα κύτταρα. Η πιο σημαντική και καλύτερα μελετημένη hsp στους ανθρώπους είναι η hsp70. Δρα ως οικιακή βοηθός του κυττάρου (house-keeping, molecular chaperon) που εμποδίζει την αποδόμηση των νεαρών πρωτεϊνών από κυτταροπλασματικά ένζυμα. Επίσης βοηθά στην τεταρτογενή πτύχωση των εν τω γεννάσθαι πρωτεϊνών και επιπλέον βοηθά στην τριτογενή και τεταρτογενή επαναπτύχωση της δομής των ενδοκυττάριων πρωτεϊνών που είχαν υποστεί αποπτύχωση (unfolding) μετά την επίδραση θερμότητας, ιονισμένης ακτινοβολίας κ.ά. Οι hsps προσφέρουν σημαντικό πλεονέκτημα στην επιβίωση του ξενιστή. Πρόσφατες μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η επαγωγή της σύνθεσης hsp70 σε κύτταρα οργάνων (πνεύμονες, ήπαρ, έντερο κ.λπ.) η οποία προκλήθηκε μετά την έκθεση των πειραματόζωων σε αυξημένη θερμοκρασία καθιστά τα πειραματόζωα αυτά πιο ανθεκτικά στη χορήγηση ενδοτοξίνης ή σε διάφορους άλλους βλαπτικούς παράγοντες της σήψης, με αποτέλεσμα να μειώνονται οι επιπλοκές και η θνητότητα της νόσου. Υπάρχουν λίγες εργασίες που να αφορούν στην επαγωγή της σύνθεσης hsps σε κύτταρα ανθρώπου και αυτές αφορούν σε ενήλικες. Έχει βρεθεί σύνθεση hsp70 στα μονοκύτταρα-μακροφάγα του ανθρώπου υπό φυσιολογικές συνθήκες και μετά από ενεργοποίηση αυτών από διάφορες τοξίνες και μεσολαβητές της φλεγμονώδους αντίδρασης. Τα ανθρώπινα λεμφοκύτταρα δεν συνθέτουν υπό φυσιολογικές συνθήκες hsp70. Εντούτοις συνθέτουν hsp70 ως απάντηση σε stress. Τουναντίον, τα ΠΜΠ του ανθρώπου συνθέτουν hsp70 και υπό φυσιολογικές συνθήκες, ενώ σε συνθήκες stress παρουσιάζουν αύξηση αυτής της παραγωγής όπως π.χ. σε υψηλή θερμοκρασία, σε υποθερμία, υπό την επίδραση προϊόντων μεταβολισμού των ΠΜΠ τα οποία παράγονται κατά την ενεργοποίησή τους (αραχιδονικό οξύ και 12-ΗΕΤE) κ.ά. Πρόσφατα περιγράφηκε αυξημένη αυτόματη σύνθεση hsp70 σε ΠΜΠ βαρέως πασχόντων πολυτραυματιών και χειρουργημένων καθώς και σε μονοκύτταρα και πολυμορφοπύρηνα σηπτικών ασθενών. Απ’ όσο γνωρίζουμε στη βιβλιογραφία υπάρχουν μόνο δυο μελέτες που αφορούν στην παραγωγή hsps σε κύτταρα πνεύμονα και εγκεφάλου νεογνών και καμμιά που να αφορά στη σήψη. Στο εργαστήριό μας μελετάμε την παραγωγή hsp70 στα ΠΜΠ των νεογνών. Πρόσφατα δείξαμε ότι τα ΠΜΠ των υγιών νεογνών συνθέτουν hsp70 υπό την επίδραση θερμικού stress. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την παραγωγή hsps στα ΠΜΠ των νεογνών σε συνθήκες σήψης. Είναι γνωστό ότι στη σήψη τα ΠΜΠ παίζουν σημαντικό ρόλο στην άμυνα του ξενιστή μέσω της ικανότητάς τους να απελευθερώνουν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και πολλούς άλλους χημικούς μεσολαβητές της φλεγμονής. Είναι όμως επίσης γνωστό ότι οι μεσολαβητές αυτοί της φλεγμονής μπορεί να δρούν τοξικά τόσο σε κύτταρα ιστών όσο και σε αυτά καθ’ αυτά τα ΠΜΠ, σε βαθμό που να τα καταστήσουν ανενεργό και ανίκανα να επιτελέσουν το φυσιολογικό αμυντικό τους ρόλο. Η αυξημένη έκφραση hsps στα ΠΜΠ των σηπτικών νεογνών ως φυσιολογικός ενδογενής μηχανισμός άμυνας σε τοξικούς παράγοντες, είναι πιθανόν να συμβάλλει στη διατήρηση της λειτουργικότητας των ΠΜΠ και ως εκ τούτου στην αντιμετώπιση του σηπτικού παράγοντα. Σκοπός αυτής της εργασίας ήταν να μελετήσουμε και να προσδιορίσουμε ποσοτικά α) την αυτόματη παραγωγή hsp70 στα ΠΜΠ νεογνών με σήψη από Gram(-) βακτηρίδια β) την παραγωγή hsp70 στα ΠΜΠ υγιών νεογνών και ενηλίκων μετά από επώαση με LPS, FMLP, LPS και FMLP και να τη συγκρίνουμε με την παραγωγή hsps στα ΠΜΠ ενηλίκων μετά από επώαση με τους ίδιους παράγοντες. Το ενδιαφέρον μας για το LPS και FMLP οφείλεται στο ότι αποτελούν παράγωγα των Gram(-) βακτηριδίων και είναι γνωστό ότι τα Gram(-) βακτηρίδια είναι οι κυρίως υπεύθυνοι μικροοργανισμοί για τη σήψη των νεογνών και γ) την παραγωγή hsp70 σε ΠΜΠ υγιών νεογνών και υγιών ενηλίκων μετά από θερμικό stress και να τη συγκρίνουμε με τις δύο προηγούμενες. Η σύνθεση hsp70 ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης/SDS και με ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της hsp70 σε νιτροκυτταρίνη. Η μέτρηση των hsp70 έγινε με πυκνόμετρο (densitometer). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τις δοκιμασίες Mann-Whitney test και Wilcoxon Signed Rank Test ανάλογα με τις ενδείξεις. Η σύγκριση της παραγωγής hsp70 ανάμεσα στα ΠΜΠ των 3 ομάδων νεογνών (σηπτικά νεογνά, νεογνά που επωάσθηκαν με LPS και FMLP και νεογνά που εκτέθηκαν σε θερμικό stress) έγινε με τη μέθοδο Kruskal-Wallis. Πιο συγκεκριμένα στη διατριβή αυτή: Μετρήθηκε η σύνθεση των hsp70: 1. Σε δείγματα ΠΜΠ 11 σηπτικών νεογνών τις πρώτες 12 ώρες από τη διάγνωση της σήψης. Διαπιστώσαμε ότι τα ΠΜΠ αυτών των νεογνών συνθέτουν in vivo πολύ υψηλά επίπεδα hsp70. p < 0.05. Η μέση τιμή hsp70 ήταν 2,04μγ/1500000 ΠΜΠ (SD 1,54) ενώ η μέση τιμή αντίστοιχα στα ΠΜΠ των υγιών νεογνών που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες ήταν 0,53μγ/1500000 ΠΜΠ (SD 0,36). Δηλαδή τα νεογνικά ΠΜΠ φαίνονται ότι διαθέτουν τον προστατευτικό μηχανισμό των hsps κατά τη σήψη. 2. Σε δείγματα ΠΜΠ 12 υγιών νεογνών και 12 υγιών ενηλίκων που είχαν επωασθεί με LPS in vitro (10ng/ml για 4,5 ώρες). Βρέθηκε ότι τόσο τα ΠΜΠ των νεογνών όσο και τα ΠΜΠ των ενηλίκων που επωάσθηκαν με LPS δεν παρήγαγαν σημαντικά αυξημένη ποσότητα hsp70 σε σχέση με αυτή που παρήγαγαν τα ΠΜΠ υγιών νεογνών και ενηλίκων που δεν είχαν εκτεθεί σε LPS (μάρτυρες), p > 0,05 και για τις δυο ομάδες. Η μέση τιμή hsp70 για τα ΠΜΠ των νεογνών ήταν 0,53μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,24) ενώ η μέση τιμή hsp70 στους μάρτυρες ήταν 0,51μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,24). Για τα ΠΜΠ των ενηλίκων η μέση τιμή hsp 70 ήταν 0,39μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,11) ενώ η μέση τιμή hsp70 στους μάρτυρες ήταν 0,33μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,18). Θεωρούμε ότι η αδυναμία των ΠΜΠ τόσο των νεογνών όσο και των ενηλίκων να αυξήσουν την παραγωγή hsp70 μετά την επώαση με LPS in vitro οφείλεται στο γεγονός ότι το LPS απλώς πριμοδοτεί τα ΠΜΠ να ενεργοποιηθούν αποτελεσματικότερα όταν εκτεθούν σε κάποιον άλλο αγωνιστή π.χ. φορμυλπεπτίδια. 3. Σε δείγματα ΠΜΠ 12 υγιών νεογνών και 12 υγιών ενηλίκων που είχαν επωασθεί με FMLP in vitro (1μΜ για 4,5 ώρες). Στα ΠΜΠ των ενηλίκων που επωάσθηκαν με FMLP διαπιστώθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων hsp70 σε σχέση με αυτή που διαπιστώθηκε στα ΠΜΠ των υγιών ενηλίκων που δεν εκτέθηκαν σε FMLP (μάρτυρες), p < 0.05. Η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των ενηλίκων που διεγέρθηκαν με FMLP ήταν 0,44μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,20) ενώ η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των μαρτύρων ήταν 0,33μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,18). Τα νεογνικά ΠΜΠ που διεγέρθηκαν με FMLP δεν παρουσίασαν αύξηση της παραγωγής hsp70 σε σχέση με τα ΠΜΠ των υγιών νεογνών που δεν επωάσθηκαν με FMLP (μάρτυρες), p > 0.05. Η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των υγιών νεογνών που ενεργοποιήθηκαν με FMLP ήταν 0,60μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,22) ενώ η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των μαρτύρων αντίστοιχα 0,51μγ/1500000 κύτταρα. (SD 0,24). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η παραγωγή hsp70 από τα νεογνικά ΠΜΠ μετά από διέγερση με φορμυλπεπτίδια υπολείπεται αυτής των ΠΜΠ των ενηλίκων, εύρημα συμβατό και με την γνωστή ελαττωμένη χημειοταξία των νεογνικών ΠΜΠ στα φορμυλπεπτίδια. 4. Σε δείγματα ΠΜΠ 12 υγιών νεογνών και 12 υγιών ενηλίκων που πριμοδοτήθηκαν πρώτα με LPS (10ng/ml για 1 ώρα) και στη συνέχεια ενεργοποιήθηκαν με FMLP (1μΜ για 3,5 ώρες ). Διαπιστώθηκε ότι όταν εκτέθηκαν σε συνδυασμό LPS και FMLP in vitro, τόσο τα νεογνικά ΠΜΠ όσο και τα ΠΜΠ των ενηλίκων παρουσίασαν σημαντική αύξηση της παραγωγής hsp70. p < 0.05 για τα νεογνά και p < 0.01 για τους ενήλικες αντίστοιχα. Η μέση τιμή hsp70 στα νεογνικά ΠΜΠ ήταν 0,66μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,42) ενώ η μέση τιμή μαρτύρων, δηλαδή ΠΜΠ υγιών νεογνών που δεν εκτέθηκαν σε LPS και FMLP, ήταν 0,51μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,24). Η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των ενηλίκων ήταν 0,54μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,23) ενώ η μέση τιμή των μαρτύρων, δηλαδή ΠΜΠ υγιών ενηλίκων που δεν εκτέθηκαν σε LPS και FMLP, ήταν 0,33μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,18). Δεν διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά ανάμεσα στα επίπεδα hsp70 που παρήχθηκε από τα ΠΜΠ των νεογνών που διεγέρθηκαν με LPS και FMLP σε σχέση με τη hsp70 που παρήχθηκε από τα ΠΜΠ των ενηλίκων που διεγέρθηκαν με LPS και FMLP. p > 0,05. 5. Σε δείγματα ΠΜΠ 11 υγιών νεογνών και 11 υγιών ενηλίκων που εκτεθήκαν σε θερμικό stress in vitro (στους 42°C για 1 ώρα). Διαπιστώθηκε ότι τα ΠΜΠ των υγιών νεογνών που εκτέθηκαν σε θερμικό stress παρουσίασαν αύξηση της παραγωγής hsp70 η οποία δεν διέφερε ουσιαστικά από την ανάλογη παραγωγή των ΠΜΠ των ενηλίκων που εκτέθηκαν στις ίδιες συνθήκες stress. p < 0,01 και p = 0,012 για τα νεογνά και τους ενήλικες αντίστοιχα. Η μέση τιμή hsp70 στα νεογνικά ΠΜΠ που εκτέθηκαν σε θερμικό stress (42°C για 1 ώρα) ήταν 1,02μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,36) ενώ η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των νεογνών που παρέμειναν στους 37 °C ήταν 0,53μγ/1500000 (SD 0,36) κύτταρα. Η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των ενηλίκων ήταν 0,57μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,42) ενώ η μέση τιμή hsp70 στα ΠΜΠ των μαρτύρων 0,35μγ/1500000 κύτταρα (SD 0,22). 6. Συγκρίνοντας τις 3 ομάδες νεογνών (σηπτικά, υγιή νεογνά που εκτέθηκαν σε θερμικό stress και υγιή νεογνά που επωάσθηκαν πρώτα με LPS και στη συνέχεια με FMLP) βρέθηκε ότι η παραγωγή hsp70 στα ΠΜΠ των σηπτικών νεογνών είναι σημαντικά μεγαλύτερη από αυτή που παρατηρείται στα ΠΜΠ των υγιών νεογνών που εκτέθηκαν σε θερμικό stress in vitro ή επωάσθηκαν με LPS και FMLP. p < 0,01. Αυτό υποδηλώνει ότι η φλεγμονώδης απάντηση στη σήψη είναι σύνθετη και εμπλέκονται σε αυτή και πολλοί άλλοι παράγοντες εκτός του LPS, FMLP και της υπερθερμίας. Συμπερασματικά από τη μελέτη μας προκύπτει ότι τα νεογνικά ΠΜΠ παράγουν αυτόματα μεγάλες ποσότητες hsp70 κατά τη διάρκεια της σήψης. Το γεγονός αυτό επιβεβαιώθηκε και in vitro όπου διαπιστώθηκε παραγωγή hsps στα ΠΜΠ του νεογνού μετά την επίδραση LPS και FMLP. Εντούτοις παρά το γεγονός ότι διαθέτουν τον προστατευτικό μηχανισμό των hsps, ο μηχανισμός αυτός δεν φαίνεται να επαρκεί για να τα προφυλάξει από την αυξημένη θνητότητα κατά τη διάρκεια της σήψης. Είναι ευνόητο ότι χρειάζεται περισσότερη έρευνα για να αυξήσουμε τις γνώσεις μας όσον αφορά στο μηχανισμό με τον οποίο δρουν οι hsps κατά τη διάρκεια της σήψης. Θεωρούμε ότι με αυτό τον τρόπο θα έχουμε κάνει ένα σημαντικό βήμα στο δρόμο για την απόκτηση νέων αποτελεσματικότερων θεραπευτικών μέσων για την επιτυχή αντιμετώπιση της νεογνικής σήψης.