Μελέτη των κυττάρων του ήπατος με ανοσοϊστοχημεία μετά από επίδραση κορτιζόνης

Abstract

In this study we have examined the effect of cortisone on hepatic cells. The biological material of our experiments was rats of the race Wistar, 8 weeks old, with a weight of about 170 gr. The environmental and nutritional conditions were stable during the experiments. The rats were separated in three groups consisted of 10 animals each. The first group was used as the control. The rats from the second group were injected with 0,4 ml of cortisone/100 gr. of weight, diluted in physiological serum, and killed 30 min after the injection while the rats from the third group were killed three hours after the injection. 5 rats from the control were killed along with the ones from the third group. The rats used as control were injected with the same amount of physiological serum as the above ones excluding the cortisone. The rats were anaesthetized by using diethylether before been killed. Biopsies were performed from each animal’s liver for studding them in the light and electron microscope. In this study we report the effect of cortisone on hepatic cells after 30 min and three hours of treatment. The changes we observed in the hepatic cells are remarkable concerning the stereomorphology of the histones and the nuclear DNA. In addition, the reaction of the basic proteins with the coloring in the nuclear is less active where the chromatin is present, in the cells derived from the second and third group animals. The reaction is less active in the nuclear especially in the cells from the animals of the second group as well as the heterochromatin is reduced in this step (PTAH method). These results suggest that the functionalism of those cells is reduced during the first 30 min of treatment with cortisone and it seems to be recovered after three hours, without reaching the physiological levels. This suggestion is confirmed by the immunolocalization of the protein on the cells. The expression pattern of the protein observed in the three biopsies (one for each group of rats) varies in relation to the above results. Our observations concerning the thin structure of the cells by classical electron microscopy suggest that the heterochromatin is slightly increased in the treated with cortisone cells, strengthening the above results. The changes observed in the cells after three hours of treatment with cortisone are more intensive than the one observed after 30 minutes. Those results suggest that the changes observed in functional and morphological level are increased along with the time after the injection with cortisone, without assuming that the time is unlimited. Recently, have reported the damage caused by cortisone in hepatic cells especially on biosynthetic level. The results from our study suggest that the changes caused in the cells from the cortisone are depending on the phase that the cells are in the moment of the injection and fixation. We observed that a number of cells are not affected while some others cells change their program. It is known that during the division, the cells are more sensitive in the affection of external factors.

Σε πειράματα που εκπονήσαμε για τη μελέτη επίδρασης κορτιζόνης σε κύτταρα ήπατος πειραματοζώων, ως βιολογικό υλικό χρησιμοποιήσαμε επίμυες της φυλής Wistar, ηλικίας οκτώ εβδομάδων και βάρους 170 +- gr περίπου. Τα πειραματόζωα παρέμειναν σε σταθερές συνθήκες περιβάλλοντος και διατροφής. Τα πειραματόζωα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες. Κάθε ομάδα αποτελείτο από δέκα πειραματόζωα. Η πρώτη ήταν η ομάδα ελέγχου, η δεύτερη τους έγινε ένεση με κορτιζόνη και θυσιάστηκαν τριάντα λεπτά μετά την ένεση ενώ η τρίτη ομάδα πειραματοζώων θυσιάστηκε τρεις ώρες μετά την ένεση κορτιζόνης, ταυτόχρονα με αυτά θυσιάσαμε και πέντε πειραματόζωα της ομάδας ελέγχου. Η ποσότητα της κορτιζόνης που ενέσαμε σε όλα τα πειραματόζωα ήταν 0,4 ml ανά 100 γραμμάρια ζώου, διαλυμένη σε φυσιολογικό ορό. Τα πειραματόζωα της ομάδας ελέγχου έλαβαν την ίδια ποσότητα φυσιολογικού ορού με αυτή που έλαβαν και τα πειραματόζωα των δυο άλλων ομάδων. Η θυσία των πειραματοζώων πραγματοποιήθηκε μετά από αναισθητοποίησή τους με αιθέρα. Αμέσως μετά την αναισθητοποίηση, τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και ελαμβάνοντο βιοψίες από το ήπαρ κάθε πειραματόζωου για μελέτη στο φωτονικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Στα πειράματά μας μελετήσαμε την επίδραση της κορτιζόνης στα κύτταρα του ήπατος τριάντα λεπτά και τρεις ώρες μετά την ένεση. Οι αλλοιώσεις που παρατηρήσαμε στα κύτταρα του ήπατος που είχε επιδράσει η κορτιζόνη σε σχέση με τα κύτταρα της ομάδας ελέγχου είναι σημαντικές, και αναφέρονται κυρίως στη στερεομορφία του πλεκτονομικού σχηματισμού των ιστονών και του DNA των πυρήνων. Επίσης η μελέτη μας έδειξε ότι η αντίδραση των βασικών πρωτεϊνών με τη χρωστική στους πυρήνες μειώνεται σε περιοχές της χρωματίνης, στις ομάδες των κυττάρων που προήρχοντο από πειραματόζωα που είχε επιδράσει η κορτιζόνη. Η αντίδραση της χρωστικής μειώνεται στους πυρήνες που προέρχονται από πειραματόζωα που είχε επιδράσει η κορτιζόνη τριάντα λεπτά, όπως επίσης οι κόκκοι της ετεροχρωματίνης ελαττώνονται αριθμητικά σε αυτό το στάδιο (Μέθοδος ΡΤΑΗ). Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας σημαίνουν ότι τα κύτταρα αυτά έχουν μειωμένη λειτουργικότητα, κατά την επίδραση της κορτιζόνης στο χρόνο των τριάντα λεπτών, ενώ στις τρεις ώρες τα ίδια κύτταρα έχουν αρχίσει να επανακτούν τη λειτουργικότητά τους όχι όμως σε φυσιολογικά επίπεδα. Αυτό μας επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα που λάβαμε από την ανοσοεντόπιση της πρωτεΐνης η οποία εκφράζετε με κόκκους και συσσωματώματα, όπου παρατηρείτε σχετική διακύμανση στην έκφρασή της μεταξύ των βιοψιών των τριών ομάδων. Οι μελέτες αυτές ενισχύονται από το γεγονός ότι οι παρατηρήσεις μας για τη λεπτή δομή των κυττάρων με την κλασσική μέθοδο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας υποδεικνύουν ελάχιστα αυξημένη την ετεροχρωματίνη, στα κύτταρα που προέρχονται από πειραματόζωα στα οποία είχε επιδράσει η κορτιζόνη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι στο χρονικό διάστημα των τριών ωρών μετά την επίδραση της κορτιζόνης, οι αλλοιώσεις των κυττάρων αυτών είναι εντονότερες σε σχέση με αυτές που παρατηρούνται στα τριάντα λεπτά μετά τη χορήγηση της κορτιζόνης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι αλλοιώσεις σε λειτουργικό και μορφολογικό επίπεδο αυξάνονται ανάλογα με το χρόνο που διέρχεται μετά τη χορήγηση κορτιζόνης, αυτό βέβαια δε σημαίνει ότι ο χρόνος αυτός είναι απεριόριστος. Πρόσφατα πειράματα που έχουν γίνει με τη χορήγηση κορτιζόνης από τους έδειξαν ότι παρατηρούνται βλάβες σε κύτταρα του ήπατος από την επίδραση της κορτιζόνης). Οι αλλοιώσεις που παρατήρησαν ήταν κυρίως σε βιοσυνθετικό επίπεδο. Από τα πειράματά μας φαίνεται ότι οι αλλοιώσεις των κυττάρων εξαρτώνται και από τη φάση που βρίσκονται τα κύτταρα τη στιγμή της επίδρασης της κορτιζόνης και της μονιμοποίησής τους. Αυτό φαίνεται από το γεγονός ότι πολλά κύτταρα δεν υφίστανται αλλοιώσεις ενώ σε άλλα μεταβάλλετε το διαχρονικό τους πρόγραμμα, τέτοιες μεταβολές πρέπει να εκφράζουν οι αλλοιώσεις που παρατηρούνται στις βασικές και όξινες πρωτεΐνες των κυττάρων του ήπατος που παρατηρήσαμε. Είναι γνωστό ότι τα κύτταρα που βρίσκονται κατά την επίδραση εξωγενών παραγόντων στη φάση της διαίρεσης είναι πιο ευαίσθητα από τα άλλα και εμφανίζουν εντονότερες αλλοιώσεις.