Η επίδραση του L-ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στις πρώιμες ιστολογικές αλλοιώσεις υπερχοληστερολαιμικών κουνελιών: πειραματική μελέτη

Abstract

Atherosclerosis, the principal cause of heart attack, stroke and gangrene of the extremities is responsible for 50% of mortality in Europe, USA and Asia. The lesions result from an inflammatory response to various forms of insult to the endothelium and smooth muscle of the artery wall. An increased concentration of plasma low density lipoprotein (LDL) cholesterol constitutes a major risk factor for atherosclerosis. Several lines of evidence support a role for oxidetively modified LDL (oxLDL) in atherosclerotic lesion formation. OxLDL leads to the expression of macrophage scavenger receptors. Scavenger receptors are not regulated by intracellular cholesterol levels and as a result, allow the uncontrolled accumulation of oxLDL cholesterol in macrophages and their transformation to foam cells. The cytoplasm of foam cells is full with lipid droplets and their appearance to the arteries is the hallmark of atherosclerotic disease. The present study was designed to investigate the influence of L-aspartate and L-glutamate on fatty streak initiation in the cholesterol-fed rabbit model of atherosclerosis. Twenty-one male New Zealand white rabbits were studied for four weeks. After two weeks of adaptation, rabbits were randomly separated into two groups. Animals in group A (n = 11) were fed with rabbit chow enriched with 0.25% cholesterol and 6% com oil and received plain tap water ad libitum. In group B (n = 10) they were fed with the same hyperlipidemic diet as in group A and furthermore they received 12.5 mM L-aspartic acid monosodium salt and 12.5 mM L-glutamic acid monosodium salt daily, in drinking water for 4 weeks. Blood samples were drawn from the central ear artery at 0,1 and 4 weeks of the study period. Total serum cholesterol and glucose determination and measurement of serum thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) content were obtained the same day with the collection of the blood samples. At the end of the study period, animals were sacrificed and a cannula was inserted through a lateral neck incision into the right carotid artery and connected to a perfusion apparatus. The thoracic aorta was perfused at a mean pressure of 100 ± 10 mmHg, first with Hanks balanced salts solution buffered with Hepes (pH 7.4) for 5 minutes and then, for 30 minutes, with dilute Karnovsky’s fixative (pH 7.2). The vessel was finally perfused, for 10 minutes with sucrose in phosphate buffer (pH 7.2). The perfused aorta was gently cleaned from all periadventitial tissue, removed and stored at 4 °C in phosphate buffer pH 7.2 until staining. To visualize intimal foam cells, the thoracic aorta was stained for 5 minutes with oil red O, rinsed for 30 seconds in isopropyl alcohol and rehydrated in phosphate buffer. The stained segment was cut open along its length and mounted in a solution of glycerol/PBS (pH 7.8). The addition of Hoechst 33342 dye to the mounting media was used to stain specifically the nuclei of mononuclear cells in these preparations. Samples of the same length were examined en face using a Zeiss Axiolab microscope. In both groups in the present study, total serum cholesterol levels increased tenfold during the experimental period without any statistical difference between groups. However serum TBARS content was decreased in animals of the group which received the two amino acids. Serum glucose elevated during the 4 weeks of dietary intervention in both groups with statistical difference between groups in the 4th week of the study period. Serum glucose was increased in the group of animals which received the amino acids. Microscopical examination of the thoracic aortas revealed that chronic oral administration of aspartate and glutamate strongly decreased mononuclear cell adhesion to the endothelium of thoracic aorta. It is known that the earliest observable abnormality of the vessel wall in hypercholesterolemic animals is enhanced mononuclear cell adhesion to the endothelium which occurs within the 1st week of a high cholesterol diet. The results of the present study indicate that aspartate and glutamate attenuate enhanced endothelial adhesiveness thereby inhibiting the first step of atherosclerotic lesion formation. The subsequent development of macrophage «foam cells» that contain massive amounts of cholesterol esters, is a hallmark of both early and late atherosclerotic lesions. L-Aspartate and L-glutamate had also a very strong effect in intimal foam cell formation. Microscopical analysis showed a very small number of intimal foam cells in the thoracic aortas of animals maintained on an oral supplementation of the two amino acids compared to the group maintained on the atherogenic diet alone. The results of this study indicate that supplementation of the atherogenic diet with aspartate and glutamate inhibits fatty streak initiation in the cholesterol-fed rabbit model of atherosclerosis. Due to the fact that serum TBARS content was decreased in animals of group which received the amino acids, it may be possible that the capacity of these substances to inhibit fatty streak initiation is related to antioxidant activity. The antioxidant activity of these amino acids has been also referred by Morita et al.. Their study provided the first evidence that supplementation of the cardiopulmonary bypass circuit (CPB) prime with aspartate and glutamate reduced lipid peroxidation when CPB is started. Elevated serum glucose levels cannot be attributed to the high cholesterol diet. However there wasn’t any animal with permanent diabetes in any group at the end of the study period. Besides the administration of amino acids wasn’t stopped the day before blood collection. In the present study, for the first time, the effect of chronic dietary administration of L-aspartate and L-glutamate in cholesterol-fed rabbits is investigated. Amino acids reduced serum TBARS content and inhibited fatty streak initiation showing that they had an antiatherogenic effect.

Η αθηροσκλήρυνση προκαλεί το 50% της ετήσιας θνησιμότητας που εμφανίζεται στην Ευρώπη, στις Ηνωμένες Πολιτείες και στο μεγαλύτερο μέρος της Ασίας. Η νόσος αυτή αποτελεί χαρακτηριστικό στοιχείο των πληθυσμών των οποίων το βιοτικό επίπεδο βελτιώθηκε σημαντικά, μετά από τις αντίξοες συνθήκες διαβίωσης των προηγούμενων ετών. Μεγάλος αριθμός μελετών αποδεικνύει ότι η οξειδωτική τροποποίηση των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (low density lipoproteins, LDL), του κύριου φορέα της χοληστερόλης του πλάσματος, κατέχει κυρίαρχο ρόλο στην εμφάνιση και στην πορεία της αθηροσκλήρυνσης. Η ύπαρξη αυτών των τροποποιημένων LDL μορφών οδηγεί στην έκφραση υποδοχέων-καθαριστών από τα μακροφάγα, σαν ένα είδος αμυντικού μηχανισμού. Οι υποδοχείς- καθαριστές δεν υφίστανται ρύθμιση από τα επίπεδα της ενδοκυττάριας χοληστερόλης με αποτέλεσμα να επιτρέπουν την ανεξέλεγκτη συσσώρευση της χοληστερόλης των oxLDL στα μακροφάγα και το συνακόλουθο μετασχηματισμό τους σε αφρώδη κύτταρα. Το κυτταρόπλασμα των αφρωδών κυττάρων είναι πλούσιο σε λιποσταγόνες και η εμφάνισή τους στις αρτηρίες αποτελεί το στοιχείο-σφραγίδα της αθηροσκλήρυνσης. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να ερευνηθεί η επίδραση του L- ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στις πρώιμες αθηρωματικές αλλοιώσεις που προκαλούνται σε λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας μετά από χορήγηση δίαιτας υψηλής περιεκτικότητας σε χοληστερόλη. Στη μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν 21 αρσενικά, λευκά κουνέλια Νέας Ζηλανδίας. Τα ζωικά πρότυπα μετά την περίοδο του εγκλιματισμού τους στον περιβάλλοντα χώρο η οποία διήρκησε δύο εβδομάδες, μοιράστηκαν σε δύο ομάδες. Στην πρώτη ομάδα (ομάδα Α, n = 11), χορηγήθηκε δίαιτα εμπλουτισμένη με 0.25% χοληστερόλη και 6% αραβοσιτέλαιο για χρονικό διάστημα 4 εβδομάδων. Η δεύτερη ομάδα (ομάδα B, n = 10) διατράφηκε με την ίδια δίαιτα και ταυτόχρονα έλαβε 12.5 mM μονονάτριου άλατος του L-ασπαρτικού οξέος και 12.5 mM μονονάτριου άλατος του L-γλουταμινικού οξέος από το πόσιμο νερό για το ίδιο χρονικό διάστημα. Στη διάρκεια της μελέτης έγιναν τρεις αιμοληψίες, στην έναρξη, στο τέλος της πρώτης εβδομάδας χορήγησης της υπερχοληστερινικής δίαιτας και πριν την ευθανασία. Στον ορό προσδιορίστηκαν η ολική χοληστερόλη, το σάκχαρο και οι ενώσεις που αντιδρούν με το θειοβαρβιτουρικό οξύ (thiobarbituric acid reactive substances, TBARS). Μετά τη συμπλήρωση του διαστήματος των τεσσάρων εβδομάδων, έγινε ευθανασία των ζώων. Με μέση θωρακοκοιλιακή τομή έγινε προσπέλαση στη θωρακική και κοιλιακή αορτή. Στη δεξιά κοινή καρωτίδα τοποθετήθηκε καθετήρας που συνδέθηκε με συσκευή έγχυσης μονιμοποιητικών διαλυμάτων. Η έγχυση των διαλυμάτων έγινε υπό πίεση 100 ± 10 mmHg, με την ακόλουθη σειρά: 1. Ρυθμιστικό διάλυμα Hanks (Hanks balanced salts, HBSS) με HEPES pH 7.4, για 5 min, 2. Διάλυμα Karnovsky pH 7.2, για 15-30 min, 3. Διάλυμα σουκρόζης σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.2, για 10 min. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας της έγχυσης η αορτή από την έκφυσή της, μέχρι το διχασμό των λαγονίων παρασκευάστηκε και αφαιρέθηκε. Στη συνέχεια απαλλάχτηκε από τον περιβάλλοντα λιπώδη ιστό, καθηλώθηκε σε ειδικό πλαίσιο στις φυσικές της διαστάσεις και συντηρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.2, στους 4 °C για 24 h. Για να γίνουν ορατά τα αφρώδη κύτταρα, τα δείγματα βάφτηκαν με τη χρωστική oil red Ο για 5 min, ξεπλύθηκαν με ισοπροπυλική αλκοόλη για 30 sec και επανυδατώθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών pH 7.2. Η θωρακική αορτή διανοίχτηκε κατά τον επιμήκη άξονα, καθηλώθηκε σε ειδικό πλαίσιο και εμβαπτίστηκε σε διάλυμα γλυκερόλης/PBS pH 7.8. Στο διάλυμα αυτό προστέθηκε η φθορίζουσα χρωστική Hoechst 33342, που εξειδικευμένα βάφει τα μονοπύρηνα κύτταρα που προσκολλώνται στην ενδοθηλιακή επιφάνεια. Τα δείγματα εξετάστηκαν en face με τη μέθοδο ανάλυσης εικόνας σε μικροσκόπιο Zeiss Axiolab. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων έδειξαν ότι τα επίπεδα της ολικής χοληστερόλης του ορού αυξήθηκαν και για τις δύο ομάδες κατά τη διάρκεια της μελέτης χωρίς να υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Παρά την αύξηση των επιπέδων της χοληστερόλης οι τιμές των TBARS εμφανίστηκαν ελαττωμένες στον ορό των ζωικών προτύπων που λάμβαναν τα αμινοξέα. Τα επίπεδα του σακχάρου του ορού ήταν αυξημένα κατά τη διάρκεια της μελέτης και στις δύο ομάδες. Η διαφορά μεταξύ τους έγινε σημαντική την 4η εβδομάδα της δίαιτας όπου τα επίπεδα του σακχάρου εμφανίστηκαν υψηλότερα στην ομάδα που λάμβανε τα αμινοξέα. Ωστόσο κανένα ζωικό πρότυπο δεν παρουσίασε μόνιμο διαβήτη. Πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι πριν από την αιμοληψία δεν γινόταν διακοπή της χορήγησης των αμινοξέων στα ζωικά πρότυπα της ομάδας Β. Η μικροσκοπική εξέταση έδειξε ότι η χορήγηση του ασπαρτικού και του γλουταμινικού παρεμπόδισε σε μεγάλο βαθμό την προσκόλληση των μονοπύρηνων κυττάρων στο ενδοθήλιο της θωρακικής αορτής. Είναι γνωστό ότι στα πρώιμα στάδια του σχηματισμού των αθηρωματικών αλλοιώσεων σε υπερχοληστερολαιμικά ζωικά πρότυπα, παρατηρείται αυξημένη προσκόλληση των μονοπύρηνων κυττάρων της κυκλοφορίας στο ενδοθήλιο από την 1η κιόλας εβδομάδα χορήγησης της υπερχοληστερινικής δίαιτας. Αυτό το φαινόμενο αποδίδεται στην έκφραση μορίων προσκόλλησης που επάγεται από την υπερχοληστερολαιμία. Τα αποτελέσματα της μελέτης αποδεικνύουν ότι τα δύο αμινοξέα εξασθένησαν το φαινόμενο αυτό, παρεμποδίζοντας το πρώτο στάδιο του σχηματισμού των λιποειδών γραμμώσεων. Ο συνακόλουθος σχηματισμός των αφρωδών κυττάρων που περιέχουν μεγάλα ποσά εστέρων χοληστερόλης αποτελεί το στοιχείο-σφραγίδα τόσο των πρώιμων όσο και των προχωρημένων αθηρωματικών αλλοιώσεων. Το ασπαρτικό και το γλουταμινικό είχαν επίσης πολλή σημαντική επίδραση στο σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων. Η μέθοδος της φωτεινής μικροσκοπίας αποκάλυψε ότι ο αριθμός των αφρωδών κυττάρων στον έσω χιτώνα της θωρακικής αορτής της ομάδας των ζωικών προτύπων που λάμβαναν τα δύο αμινοξέα ήταν πολύ μικρότερος συγκριτικά με τον αντίστοιχο αριθμό της άλλης ομάδας. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης τεκμηριώνουν την υπόθεση ότι το L-ασπαρτικό και το L-γλουταμινικό προστατεύουν το αρτηριακό τοίχωμα από τη συσσώρευση αφρωδών κυττάρων και καθυστερούν την εμφάνιση των αθηρωματικών αλλοιώσεων. Οι ελαττωμένες τιμές των TBARS του ορού των ζωικών προτύπων που λάμβαναν τα αμινοξέα αυτά ταυτόχρονα με την υπερχοληστερινική δίαιτα οδηγούν στην υπόθεση ότι η δράση τους μπορεί να είναι αντιοξειδωτικής προέλευσης. Η χρήση του L-ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στην εκστρατεία της θεραπευτικής αντιμετώπισης της αθηροσκλήρυνσης, παρουσιάζει το πλεονέκτημα ότι οι ουσίες αυτές δεν είναι προϊόντα οργανικής σύνθεσης και δεν εμφανίζουν τοξικές ιδιότητες. Τέλος θα πρέπει να τονιστεί ότι δεν υπάρχει βιβλιογραφία που να αναφέρεται στην επίδραση του L-ασπαρτικού και του L-γλουταμινικού στην αθηροσκλήρυνση σε in vivo μελέτες.