Κινητική της ενδοφλεβίου χορήγησης των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Επίδρασή τους στο οξειδωτικό δυναμικό και στη βακτηριοκτόνο ικανότητα του ορού

Abstract

Background: In order to study the intravenous administration of two n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs), gamma-linolenic acid (GLA) and arachidonic acid (AA) we have determinate the early changes of serum fatty acids and the changes on the total oxidant and antioxidant status. Based on previous findings on the in vitro synergy of n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) with ceftazidime and amikacin on multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa, the present study focused on the ex vivo effect of arachidonate-enriched serum on these isolates. In order to study whether Pseudomonas aeruginosa may trigger peroxidation of polyunsaturated fatty acids, one clinical isolate was ex vivo incubated with serum derived from rabbits administered gamma-linolenic acid (GLA). Methods: After determination of the maximal tolerated dose in eight rabbits, an emulsion of GLA was administered intravenously by the left jugular vein in seven rabbits and an emulsion of AA was administered in eleven rabbits at a dose of 25mg/kg within 10 minutes. Blood samples from the hepatic veins and from the carotid artery were collected at 15-minute time intervals from catheters inserted in the hepatic veins and in the carotid artery. Analysis of serum fatty acids was performed by GC-MS. Oxidant status was determined by the thiobarbiturate assay and total antioxidant status (TAS) was assessed by a colorimetric assay. Sampled sera were separately ex vivo incubated with a 5x105 CFU/ml log-phase inoculum of two multidrug-resistant P.aeruginosa isolates in the presence of 16pg/ml of ceftazidime and of 16pg/ml of amikacin; the latter concentration representing their mean serum level after administration of their conventional dose. Bacterial cell counts were determined during incubation along with lipid peroxidation expressed as the concentration of malonodialdehyde (MDA) measured by the thiobarbiturate assay. Concentrations of malonodialdehyde were determined during ex vivo incubation with Pseudomonas aeruginosa by the thiobarbiturate assay. Results: Elevated concentrations of elongated fatty acids were detected in the hepatic veins after infusion. Mean concentrations of arachidonate in the hepatic veins and the carotid arteries after infusion of AA were 2.77 and 3.73 μΜ respectively. The i.v. administration of PUFAs accompanied by an increase of malonodialdehyde concentrations in the hepatic veins and in the carotid artery 30 to 45 minutes respectively after the end of the infusion of GLA and/or AA. Similar changes did not occur in red cell membranes after the infusion of AA. TAS presented reciprocal changes to malonodialdehyde production; the main consumption of TAS was observed in all samples 30 to 60 minutes after the end of the infusion of n-6 PUFAs. Synergy between sera sampled after infusion of AA either from the hepatic veins or from the carotid artery with both antimicrobials was mainly found at the fifth hour of growth whereas it was not found at the 24th hour of growth. The ex vivo interaction at the fifth hour of growth was equivalent to mean log10 decreases of viable cell counts from the baseline ranging between of 2.22 and 3.71 and it was accompanied by peak levels of MDA. Stimulation of lipid peroxidation as compared to its basal levels was mainly observed over the first three hours of incubation in the presence of samples collected 30 to 60 minutes after the end of the infusion of GLA. After infusion of GLA concentrations of arachidonic acid in serum increased to concentrations within those detected in sepsis. Conclusions: These results render the necessity for further studies to clarify the significance of n-6 PUFAs in conditions like cancer and infectious diseases. The presented data may render future perspectives for the therapeutic management of infections by multidrug-resistant nosocomial isolates in animal models.

Μελετώντας την ενδοφλέβιο χορήγηση δύο ω-6 των ΠΛΟ, του γ-λινολενικού (GLA) και του αραχιδονικού οξέος (ΑΑ), προσδιορίστηκαν οι πρώιμες μεταβολές των λιπαρών οξέων του ορού μετά την έγχυση διαλύματος ΑΑ και οι μεταβολές του οξειδωτικού και αντιοξειδωτικού δυναμικού που προκαλεί η χορήγηση των δύο ω-6 ΠΛΟ. Βασισμένοι σε προηγούμενες παρατηρήσεις in vitro συνέργιας των ΠΛΟ με κεφταζιδίμη και αμικασίνη έναντι πολυανθεκτικών στελεχών Pseudomonas aeruginosa, καταγράψαμε την ex vivo επίδραση ορού εμπλουτισμένου με ΑΑ στα βακτηριακά αυτά στελέχη. Για τη μελέτη της επαγωγής της υπεροξείδωσης των ΠΛΟ από την Pseudomonas aeruginosa, ένα απομονωθέν της στέλεχος επωάστηκε ex vivo με ορό προερχόμενο από κουνέλια στα οποία χορηγήθηκε GLA. Μετά τον προσδιορισμό της μέγιστης ανεκτής δόσης σε οκτώ κουνέλια, χορηγήθηκε ενδοφλεβίως διάλυμα GLA μέσω της αριστερής σφαγίτιδας σε επτά ζωικά πρότυπα ενώ διάλυμα ΑΑ χορηγήθηκε σε έντεκα κουνέλια σε δόση 25mg/kg σε 10 λεπτά. Δείγματα αίματος από τις ηπατικές φλέβες και τις καρωτίδες λήφθησαν προ, στο μέσο, στο τέλος της έγχυσης και σε διαστήματα 15 λεπτών μετά μέχρι συμπληρώσεως μίας ώρας. Προσδιορισμός και ανάλυση των λιπαρών οξέων του ορού έγινε με GC-MS. Το οξειδωτικό δυναμικό προσδιορίστηκε με την μέθοδο του θειοβαρβιτουρικού οξέος και το ολικό αντιοξειδωτικό δυναμικό με χρωματομετρική μέθοδο. Δείγματα ορού επωάστηκαν ex vivo με 5x105 CFU/ml ενοφθάλμισμα λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης δύο πολυανθεκτικών στελεχών P.aeruginosa παρουσία 16pg/ml κεφταζιδίμης και 16pg/ml αμικασίνης. Οι συγκεντρώσεις αυτές αντιπροσωπεύουν τα επίπεδα των αντιμικροβιακών αυτών στο ορό μετά τη χορήγηση των συνηθισμένων δόσεων. Ο προσδιορισμός της ανάπτυξης του βακτηριακού πληθυσμού έγινε παράλληλα με τη μέτρηση της λιπιδιακής υπεροξείδωσης όπως αυτή εκφράστηκε με τις συγκεντρώσεις της μαλονοδιαλδεύδης (MDA). Οι συγκεντρώσεις της μαλονοδιαλδεύδης προσδιορίστηκαν και κατά την επώαση ex vivo με Pseudomonas aeruginosa με την μέθοδο του θειοβαρβιτουρικού οξέος. Αυξημένες συγκεντρώσεις λιπαρών οξέων μακράς αλύσου προσδιορίστηκαν στις ηπατικές φλέβες μετά την έγχυση. Οι μέσες συγκεντρώσεις του ΑΑ στις ηπατικές φλέβες και στις καρωτίδες μετά την χορήγηση ΑΑ ήταν 2,77 και 3,73 μΜ αντίστοιχα. Η i.v. χορήγηση ΠΛΟ συνοδεύτηκε από αυξημένα επίπεδα MDA στις ηπατικές φλέβες και στις καρωτίδες 30 και 45 λεπτά αντίστοιχα μετά το τέλος της έγχυσης GLA και ΑΑ. Ανάλογες μεταβολές δεν πραγματοποιήθηκαν στις μεμβράνες των ερυθρών αιμοσφαιρίων μετά χορήγηση ΑΑ. Το ολικό αντιοξειδωτικό δυναμικό παρουσίασε αντίστροφη μεταβολή σε σχέση με την παραγωγή ΜDA. Η μέγιστη κατανάλωση TAS παρατηρείται σε όλα τα δείγματα 30 και 60 λεπτά μετά το τέλος της έγχυσης των ω-6 ΠΛΟ. Συνέργεια μεταξύ ορού προερχόμενου μετά την χορήγηση του ΑΑ , είτε από τις ηπατικές φλέβες είτε από τις καρωτίδες, με τα αντιμικροβιακά, παρατηρείται κυρίως την πέμπτη ώρα της ανάπτυξης, ενώ την 24η ώρα ανάπτυξης δεν σημειώνεται συνέργεια. Η ex vivo επίδραση είχε ως αποτέλεσμα την μέση δεκαδική μείωση των ζώντων κυτταρικών πληθυσμών σε σχέση με τους μάρτυρες, 5η ώρα ανάπτυξης, η οποία κυμαινόταν μεταξύ 2,22 και 3,71. Η ανασταλτική αυτή επίδραση συνοδεύτηκε από αυξημένα επίπεδα MDA. Η επαγωγή της λιπιδιακής υπεροξείδωσης σημειώθηκε κυρίως στις τρεις ώρες επώασης παρουσία δειγμάτων που ελήφθησαν 30 και 60 λεπτά μετά το τέλος της έγχυσης GLA. Συμπερασματικά μπορούμε να αναφέρουμε ότι η ενδοφλέβια χορήγηση ΑΑ σε κουνέλια προκαλεί ταχεία αύξηση των λιπαρών οξέων μακράς αλύσου του ορού καθώς επίσης και των επιπέδων του ΑΑ. Η έγχυση και των δύο ΠΛΟ προκάλεσε ταχείες μεταβολές της ισορροπίας οξειδωτικού-αντιοξειδωτικού δυναμικού του οργανισμού, ενώ ορός από ζωικά πρότυπα που έλαβαν ΑΑ πιθανόν να δρα συνεργικά με την κεφταζιδίμη και τηv αμικασίνη έναντι πολυανθεκτικών στελεχών Ρ. aeruginosa. Τέλος παρατηρήθηκε επαγωγή της λιπιδιακής υπεροξείδωσης από νοσοκομειακά στελέχη, γεγονός που μπορεί να αποτελεί παθογεννετικό μηχανισμό της σήψης.