Βιοχημική διερεύνηση της παθοβιολογίας του αποφολιδωτικού συνδρόμου των οφθαλμών

Abstract

Exfoliation syndrome (XFS) is a pathological condition characterized by the synthesis and deposition of thin, white, grainy material upon and within ocular and extraocular tissues. It is thought, nowadays, to be the most common identifiable condition leading to the development of exfoliation glaucoma (XFG) and blindness. XFS is an age-related, generalised disorder of extracellular matrix, due to excessive synthesis and defective degredation of matrix components. Oxidative stress is involved in the development of XFS. The study of certain factors that are related to oxidative stress, as ultraviolet radiation, growth factors, endothelines, metalloproteases etc., can provide important information on the investigation of the pathophysiology of the disorder and the discovery of effective measures for its prevention and treatment. For our studies we used aqueous humour samples from patients with XFS and patients with cataract (controls) from the Department of Ophthalmology, AHEPA, and trabecular meshwork cells samples from cornea transplantation parts from the AHEPA eye bank. We used the following methods: i) enzyme-assays and immune-assays, ii) zymography, iii) cell cultures. Our findings indicate the involvement of gelatinases in the pathogenesis of XFS. These enzymes may change the compositition of extracellular matrix. We observed that the total gelatinolytic activity is reduced and that the total concentration of MMP2 is elevated in the aqueous humour of patients with XFS compared to controls. On the other hand there was no statistically significant difference in the total concentration of MMP9 between the two groups. Afterwards, we studied gelatinases by zymography, discovering changes in the levels of the pro-forms and the active forms of the enzymes. All four types of the enzymes were detected in the aqueous humour of patients with XFS and controls. We observed a reduction in both forms of MMP2 (pro-form and active) and also in active MMP9, a fact that can explain the reduction of the total gelatinolytic activity that was measured by ELISA, and the accumulation of extracellular matrix. For MMP9 an increase of the pro-form was observed but it was followed by a reduction of the active form. Growth factors, that arrive from plasma through the blood-aqueous barrier or that are produced locally, may play an important role in several ocular disorders as XFS. The concentration of growth factors in the aqueous humour may change in pathological conditions. We observed a significant increase of active TGF-β1 in the aqueous humour of patients with XFS compared to controls, supporting the theory that mechanisms of abnormal synthesis and decomposition of extracellular matrix, due to increased concentration of active TGF-β1, may be involved in the pathophysiology of XFS. In order to study the effect of oxidative stress in XFS, we used two biochemical markers of oxidative stess (8-isoprostaglandin F₂ₐ and protein carbonylation levels) and the antioxidant ascorbic acid. We observed a significant increase of the two biochemical markers of oxidative stess (8-IPGF₂ₐ and protein carbonylation levels) and a significant decrease of the antioxidant ascorbic acid in the aqueous humour of patients with XFS compared to controls. This is consistent with the theory of the important role of oxidative stress in XFS. In our study we also documented a significantly higher concentration of ET-1 in the aqueous humour of patients with XFS compared to the controls. Since ET-1 is considered one of the most powerful vasoconstrictors, the elevated aqueous humour concentration of this molecule may play a significant role in the pathophysiology of the iris vascular changes in XFS. In the next stage, we attempted to create a novel experimental model in order to study the interactions between several factors in XFS. At first, we prepared stable and repeatable cell cultures from the trabecular meshwork obtained from corneal transplantation parts. Then, we began our studies of the factors involved in XFS, based on our findings in the aqueous humour, and we measured the levels of ET-1 and TGF-β1 in the supernatant by ELISA. We discovered an increase of ET-1 in cells incubated with 8-IPGF₂ₐ and TGF-β1, explaining, therefore, our findings in the aqueous humour and supporting the belief that these factors interact in the induction of oxidative stress and the pathogenesis of XFS. TGF-β1 was not affected by 8-IPGF₂ₐ, on the other hand TGF-β1 was increased by the strong oxidant Η₂Ο₂. These findings, which are internationally original, suggest a strong relationship between the factors involved in oxidative stress. This model can be a valuable tool in the study of XFS and the investigation of the factors involved in it and its development in XFG.

Το σύνδροµο αποφολίδωσης (ΣΑ) αποτελεί µια παθολογική κατάσταση, η οποία χαρακτηρίζεται από την παραγωγή και εναπόθεση λεπτού, λευκού, κοκκώδους υλικού σε οφθαλµικούς και άλλους ιστούς του σώµατος. Η νόσος αυτή θεωρείται, σήµερα, η συχνότερα αναγνωρίσιµη πρόδροµη κατάσταση για την ανάπτυξη γλαυκώµατος και πρόκληση τύφλωσης. Πρόκειται για µια συσχετιζόµενη µε την ηλικία, γενικευµένη διαταραχή της εξωκυττάριας ουσίας, που χαρακτηρίζεται από προοδευτική άθροιση εξωκυττάριου υλικού λόγω υπερβολικής σύνθεσης και µη αποτελεσµατικής αποικοδόµησής του. Στην ανάπτυξη του ΣΑ εµπλέκεται το οξειδωτικό στρες. Η µελέτη ορισµένων παραγόντων που σχετίζονται µε το οξειδωτικό στρες, όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οι αυξητικοί παράγοντες, οι ενδοθηλίνες, οι µεταλλοπρωτεάσες κ.α., µπορεί να παρέχει σηµαντικές πληροφορίες για την διερεύνηση της παθοφυσιολογίας της νόσου και την εύρεση αποτελεσµατικών µέτρων για την πρόληψη και θεραπεία της. Για τις µελέτες µας χρησιµοποιήσαµε δείγµατα υδατοειδούς υγρού ασθενών µε ΣΑ και ασθενών µε καταρράκτη (µάρτυρες) από την Οφθαλµολογική Κλινική του ΑΧΕΠΑ καθώς και δείγµατα κυττάρων του ηθµοειδούς πετάλου από κοµβία υπολειµµάτων µεταµοσχεύσεων κερατοειδούς χιτώνα από την τράπεζα οφθαλµών του ΑΧΕΠΑ. Οι µέθοδοι που χρησιµοποιήσαµε ήταν: i) ενζυµικές και ανοσοχηµικές, ii) ζυµογραφία, iii) κυτταροκαλλιέργειες. Τα ευρήµατά µας δείχνουν εµπλοκή των ζελατινασών στην παθογένεση του ΣΑ. Είναι πιθανόν τα ένζυµα αυτά να µεταβάλλουν τη σύσταση της εξωκυττάριας ουσίας. ∆ιαπιστώσαµε ότι η ολική ζελατινολυτική ενεργότητα είναι ελαττωµένη και η ολική ΜΜΡ2 είναι αυξηµένη στο υδατοειδές υγρό ασθενών µε ΣΑ σε σχέση µε τους µάρτυρες, ενώ για την ΜΜΡ9 δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ των δύο οµάδων. Στη συνέχεια, µελετήσαµε τις ζελατινάσες µε τη µέθοδο της ζυµογραφίας, διαπιστώνοντας µεταβολές στα επίπεδα των προ-ενζύµων και των ενεργών µορφών. Συγκεκριµένα, ανιχνεύθηκαν και οι 4 µορφές των ζελατινασών στο υδατοειδές υγρό των ασθενών µε ΣΑ και των µαρτύρων. Παρατηρήσαµε µια µείωση και των δύο µορφών της ΜΜΡ2 (προ-ενζύµου και ενεργού) και της ενεργού ΜΜΡ9 στο ΣΑ, γεγονός που µπορεί να εξηγήσει τη µείωση της ολικής ζελατινολυτικής ενεργότητας που διαπιστώσαµε, καθώς και τη συσσώρευση της εξωκυττάριας ουσίας. Για την ΜΜΡ9 παρατηρήθηκε µια αύξηση του προενζύµου, η οποία όµως συνοδεύεται από ελάττωση της ενεργού µορφής. Οι διάφοροι αυξητικοί παράγοντες, που προέρχονται από το πλάσµα και διέρχονται τον αιµατο-υδατοειδή φραγµό ή που παράγονται τοπικά, ίσως συµβάλουν στην ανάπτυξη οφθαλµικών διαταραχών όπως το ΣΑ. Η συγκέντρωση των αυξητικών παραγόντων στο υδατοειδές υγρό µπορεί να µεταβληθεί σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Παρατηρήσαµε µια σηµαντική αύξηση του TGF-β1 σε ασθενείς µε ΣΑ σε σχέση µε τους µάρτυρες, γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι µηχανισµοί ανώµαλης σύνθεσης και αποικοδόµησης της εξωκυττάριας ουσίας, λόγω της αυξηµένης συγκέντρωσης ενεργού TGF-β1, ίσως, να εµπλέκονται στην παθοφυσιολογία του ΣΑ. Για τη µελέτη της επίδρασης του οξειδωτικού στρες στο ΣΑ χρησιµοποιήσαµε δυο βιοχηµικούς δείκτες (8-ισοπροσταγλανδίνη F2a και επίπεδα καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών), καθώς και το αντιοξειδωτικό ασκορβικό οξύ. ∆ιαπιστώσαµε σηµαντική αύξηση των δύο βιοχηµικών δεικτών του οξειδωτικού στρες (8-IPGF2a, επίπεδα καρβονυλίωσης των πρωτεϊνών) και σηµαντική µείωση του αντιοξειδωτικού ασκορβικού οξέος σε ασθενείς µε ΣΑ σε σχέση µε τους µάρτυρες, ισχυροποιώντας την άποψη της σηµαντικής συµβολής του οξειδωτικού στρες στο ΣΑ. Στη µελέτη µας διαπιστώσαµε, επίσης, µια σηµαντικά υψηλότερη συγκέντρωση ET-1 στο υδατοειδές υγρό ασθενών µε ΣΑ συγκριτικά µε τους µάρτυρες. ∆εδοµένου ότι η ΕΤ-1 θεωρείται ένας από τους ισχυρότερους αγγειοσυσπαστές, η αυξηµένη συγκέντρωση αυτού του µορίου στο υδατοειδές υγρό µπορεί να έχει έναν σηµαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία των αγγειακών µεταβολών της ίριδας στο ΣΑ. Στο επόµενο στάδιο, θελήσαµε να δηµιουργήσουµε ένα πρωτότυπο πειραµατικό µοντέλο µελέτης της αλληλεπίδρασης των διάφορων παραγόντων στο ΣΑ. Αρχικά, παρασκευάσαµε σταθερές και επαναλήψιµες κυτταροκαλλιέργειες από κύτταρα του ηθµοειδούς πετάλου κοµβίων υπολειµµάτων µεταµοσχεύσεων κερατοειδούς. Έπειτα, ξεκινήσαµε τις µελέτες µας σχετικά µε τους παράγοντες που ενέχονται στο ΣΑ, µε βάση τα ευρήµατά µας στο υδατοειδές υγρό, µετρώντας τα ποσά της ET-1 και του TGF-β1 στο υπερκείµενο διάλυµα µε µέθοδο ELISA. ∆ιαπιστώσαµε αύξηση της ΕΤ-1 σε κύτταρα που είχαν επωαστεί µε 8-IPGF₂ₐ και TGF-β1, αποτέλεσµα που εξηγεί τα ευρήµατά µας στο υδατοειδές υγρό και ενισχύει την άποψη της αλληλεπίδρασης των παραγόντων αυτών στην πρόκληση οξειδωτικού στρες και την παθογένεση του ΣΑ. Ο TGF-β1 δεν επηρεάστηκε από την 8-IPGF₂ₐ , ενώ αυξήθηκε από το ισχυρό οξειδωτικό Η₂Ο₂. Αυτά τα ευρήµατα, τα οποία είναι διεθνώς πρωτότυπα, υποδηλώνουν µια ισχυρή συσχέτιση των παραγόντων που ενέχονται στο οξειδωτικό στρες. Το µοντέλο αυτό µπορεί να αποτελέσει ένα πολύτιµο εργαλείο στη µελέτη του ΣΑ και στη διευκρίνιση των παραγόντων που συµβάλλουν σε αυτό και στην εξέλιξή του σε ΓΑ.