Μελέτη της επίδρασης βιολογικά δραστικών λιποειδών και αντιφλεγμονωδών ουσιών σε αθηρωματικές πλάκες

Abstract

Cardiovascular diseases are the main cause of death in the western world and are the clinical outcomes of atherosclerosis, a multi-factorial vascular disease, which is treated successfully with statin drugs. Up until now the clarification of the mechanism of atherosclerosis initiation, namely atherogenesis, remains an unsolved and very important step towards understanding and treating cardiovascular disease. Recently our research group has proposed the “implicating PAF atherogenesis theory”. PAF is a highly inflammatory and oxidative lipid factor. In previous studies we have reported that compounds exerting inhibitory effect against PAF can be isolated from foods of Mediterranean diet and mostly from olive oil, which was reported to contain highly potent PAF inhibitors. The fraction containing these inhibitors from olive oil (OOPL) and from olive pomace (PPL) can also inhibit atherosclerotic lesion development on cholesterol-fed rabbits. In the present dissertation the following aspects were studied for the first time and the respective original results are: 1) Besides olive pomace, biologically active compounds, namely PAF inhibitors, were isolated from olive-oil industry by-products, such as waxes, carbon and olive oil waste waters. Handling these by-products constitutes a problem for olive oil producing countries, since these by-products are highly toxic for the envirronment. 2) Further in vitro studies on OOPL and PPL, resulted that these fractions have similar fatty acid composition, even though PPL contains fewer fatty acids and no ω-6 at all, compared to OOPL. Both fractions exhibit weak anti-microbial action, whereas both exhibit their biological action through the specific PAF receptor. 3) In addition, the statin effect was studied on PAF-induced aggregation of platelets both human and rabbits. The results are that all statins inhibit PAF action. In vivo study on healthy volunteers, resulted in that simvastatin administration reduces PAF levels produced during acute conditions (lyso-PAF ΑΤ activity), and reduces the activity of plasma PAF-AH, which is the regulatory enzyme of PAF bio-degradation. The biosynthesis of constitutive PAF levels (PAF-CPT activity) was unaffected by simvastatin administration. Finally, the results on EC50 values, which express the aggregatory ability of human PRP, showed that this ability does not vary similarly, neither in control group, nor in simvastatin group. This is mostly because EC50­ values are dependent from various factors, such as diet, life-style, genetic background, thus these values cannot provide a clear depiction of the aggregatory ability of human platelets. 4) An in vivo study was performed in rabbits, in order to study atherosclerosis regression. This showed that atherosclerosis progression stops in rabbits whose diet was enriched with either PPL (reported for the first time) or simvastatin, as already reported. Moreover, EC50 values, levels of triacylglycerol, total, HDL- and LDL- cholesterol, plasma PAF-AH activity and resistance to in vitro oxidation were studied. From the results it is concluded that in rabbit groups, that received PAF-antagonists (PPL and simvastatin) in their diet, the high PAF or/and PAF-like lipids levels could not have the same impact on their cell-targets (such as platelets, macrophages and foam cells). This results in reduction of the initial atherogenesis signal, and therefore reduction of plasma PAF-AH activity and inhibition of atherosclerosis progression. Summarizing, we can claim that this study provides a biochemical approach and explanation not only on the Mediterranean diet protective effect against cardiovascular diseases, but on olive oil therapeutic effect. An additional finding is that olive oil’s biologically active compounds are present in olive pomace, as well. This study reveals new approaches for possible use of these compounds as diet supplementations or/and drugs. Finally, this study reinforces the “PAF-implicating atherogenesis theory”.

Τα καρδιαγγειακά νοσήματα είναι αυτή τη στιγμή η κυριότερη αιτία θανάτου στον δυτικό κόσμο και αποτελούν τη κλινική έκβαση της αθηροσκλήρωσης, μιας πολυπαραγοντικής αγγειακής νόσου, στην οποία χρησιμοποιούνται επιτυχώς οι στατίνες σαν φάρμακα. Μέχρι σήμερα η διαλεύκανση του μηχανισμού έναρξης της αθηροσκλήρωσης, δηλαδή της αθηρογένεσης, παραμένει ένα πολύ σημαντικό βήμα ως προς την κατανόηση και θεραπεία των καρδιαγγειακών νοσημάτων. Σχετικά πρόσφατα η ερευνητική μας ομάδα διατύπωσε τη “θεωρία αθηρογένεσης με εμπλοκή του PAF”, ενός ισχυρά φλεγμονώδους και οξειδωτικού λιποειδικού παράγοντα. Προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι ενώσεις με ανασταλτική δράση έναντι του PAF βρίσκονται σε τρόφιμα της Μεσογειακής δίαιτας και κυρίως στο ελαιόλαδο, το οποίο βρέθηκε ότι περιέχει αρκετά ισχυρούς αναστολείς του PAF. Το κλάσμα που περιέχει τους εν λόγω αναστολείς από το ελαιόλαδο (OOPL) και ελαιοπυρήνα (PPL) αναστέλλει το σχηματισμό αθηρωματικών πλακών σε κουνέλια που τρέφονται με αθηρογόνο δίαιτα. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν για πρώτη φορά τα παρακάτω θέματα με τα ακόλουθα πρωτότυπα αποτελέσματα: 1) Εκτός από τον ελαιοπυρήνα και σε άλλα παραπροϊόντα της ελαιουργίας βρέθηκε ότι υπάρχουν βιολογικά δραστικές ενώσεις που είναι αναστολείς του PAF, όπως στους κηρούς, τον ενεργό άνθρακα και τα υδατικά εκπλύματα του ελαιολάδου, η διαχείριση των οποίων αποτελεί πρόβλημα για τις ελαιοπαραγωγικές χώρες, διότι είναι ισχυρώς τοξικά για το περιβάλλον. 2) Περαιτέρω in vitro μελέτες στα κλάσματα OOPL και PPL έδειξαν ότι έχουν παρόμοια σύσταση σε λιπαρά οξέα, αν και το PPL έχει λιγότερα και καθόλου ω-6 λιπαρά οξέα συγκριτικά με το OOPL. Και τα δύο κλάσματα έχουν μια μικρή αντι-μικροβιακή δράση, ενώ και τα δύο ασκούν τις βιολογικές τους δράσεις μέσω του ειδικού υποδοχέα του PAF. 3) Μελετήθηκε, επίσης, η δράση διαφόρων στατινών στην προκαλούμενη από τον PAF συσσώρευση αιμοπεταλίων τόσο από άνθρωπο όσο και από κουνέλι και βρέθηκε ότι όλες οι στατίνες αναστέλλουν την δράση του PAF. In vivo μελέτη σε υγιείς ανθρώπους έδειξε ότι η χορήγηση simvastatin μειώνει τα επίπεδα PAF που παράγονται σε οξείες καταστάσεις (δραστικότητα lyso-PAF ΑΤ), κι ως εκ τούτου μειώνει και τη δραστικότητα PAF-AH πλάσματος που είναι το ρυθμιστικό ένζυμο για την αποικοδόμηση του PAF στον οργανισμό. Η βιοσύνθεση βασικών επιπέδων PAF (δραστικότητα PAF-CPT) δεν επηρεάζεται από τη χορήγηση simvastatin. Τέλος, τα αποτελέσματα για τις τιμές EC50, που εκφράζουν την ικανότητα συσσώρευσης του ανθρώπινου PRP, έδειξαν ότι αυτή δεν μεταβάλλεται με όμοιο τρόπο ούτε στην ομάδα αναφοράς ούτε στην ομάδα που χορηγήθηκε simvastatin, γιατί οι τιμές EC50 εξαρτώνται από πολλούς παράγοντες, όπως η διατροφή, ο τρόπος ζωής, το γενετικό υπόβαθρο, οπότε οι τιμές EC50 δεν μπορούν να δώσουν μια σαφή εικόνα για την ικανότητα συσσώρευσης των ανθρώπινων αιμοπεταλίων. 4) Έγινε in vivo μελέτη της υποστροφής της αθηροσκλήρωσης σε κουνέλια που έδειξε ότι η πρόοδος της αθηροσκλήρωσης σταματά μόνο στα κουνέλια στα οποία η τροφή είχε εμπλουτιστεί με PPL, αλλά και με simvastatin (πράγμα σύμφωνο και με τη βιβλιογραφία). Μελετήθηκαν ακόμα οι τιμές EC50 (δηλαδή η ικανότητα συσσώρευσης των αιμοπεταλίων κουνελιών), τα επίπεδα ολικής και HDL-χοληστερόλης, της LDL-χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, η δραστικότητα της PAF-AH στο πλάσμα και η αντίστασης του πλάσματος στην in vitro οξείδωση. Από τα στοιχεία αυτά συμπεραίνουμε ότι στις ομάδες που λαμβάνουν PAF-ανταγωνιστές (PPL και simvastatin) με την τροφή, τα υψηλά επίπεδα PAF και/ή PAF-αναλόγων δεν μπορούν να έχουν την ίδια δραστικότητα πάνω στα κύτταρα-στόχους τους (αιμοπετάλια, μακροφάγα και αφρώδη κύτταρα). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα να μειώνεται η ενίσχυση του αρχικού σήματος αθηρογένεσης, κι επομένως μείωση της δραστικότητας PAF-AH πλάσματος και αναστολή της προόδου της αθηροσκλήρωσης. Συνοψίζοντας, μπορούμε να ισχυριστούμε ότι η μελέτη αυτή δίνει μια βιοχημική εξήγηση όχι μόνο στην προστατευτική δράση της Μεσογειακής δίαιτας έναντι των καρδιοπαθειών, αλλά και στη θεραπευτική δράση του ελαιολάδου. Διαπιστώνει, επίσης, ότι τα δραστικά συστατικά του ελαιολάδου που είναι υπεύθυνα γι αυτή τη δράση περιέχονται και στο κλάσμα των πολικών λιποειδών του ελαιοπυρήνα (PPL). Ακόμα ανοίγει νέους δρόμους για πιθανή χρήση των συστατικών αυτών σαν συμπληρώματα διατροφής ή/και φαρμακευτικά σκευάσματα. Τέλος, ενισχύει την προταθείσα «θεωρία σχηματισμού αθηρωματικών πλακών με εμπλοκή του PAF».