Αδρενεργική παρέμβαση στην ανοσολογική απόκριση υγιών εθελοντών

Abstract

In this study we investigated the effect of dobutamine and norepinephrine on cytokine production after simulation of whole blood with 500 pg of LPS ex-vivo. Ten male healthy volunteers served as blood donors. Blood was collected and processed under specific protocol. All of them were male residents of the urban area of Athens (mean age 33.6 ± 1.5 years). Medical history, physical examination, hematological and biochemical screening and electrocardiogram were all normal. The participants did not smoke, did not take any medication and did not have any febrile illness in the month before the study. Blood samples were collected via a peripheral vein at the same time (8.00 am) after the subjects were acclimatized for 60 min at room temperature and were placed in tubes containing EDTA and immediately transferred to the lab for processing. Briefly, heparinized blood from healthy volunteers’ donors was diluted 1:10 in RPMI 1640 culture medium. One hundred μL of blood sample were added in 900 μL of RPMI 1640 for final volume 1 ml and placed to plastic culture dishes. Samples were added to wells and maintained at 37o C in a 5% CO2 atmosphere and LPS was added at different doses. Norepinephrine and dobutamine were added in concentrations 10-4, 10-5 και 10-6 Μ. Metoprolol, a β1 adrenergic blocker was added in concentration 10-5 Μ. After 4 hours incubation period the culture plate was briefly centrifuged (1800 rpm, 5 min) and supernatants were collected and stored at - 20o C until measurements. Subsequently, cytokines levels in the supernatant were evaluated by the ELISA. In this study, we have demonstrated that in the blood of healthy volunteers norepinephrine and dobutamine lead to a dose-dependent reduction of the production of TNF-α and IL-6 (proinflammatory cytokines) and this reduction is associated with β1-adrenergic mechanism, because it is reversed by metoprolol (β1-adrenergic inhibitor).

Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε την επίδραση της δοβουταμίνης και της νορεπινεφρίνης στην ανοσολογική απάντηση ολικού αίματος που λήφθηκε από 10 άρρενες υγιείς εθελοντές μετά από διέγερση με LPS. Οι υγιεις εθελοντές ήταν μόνιμοι κάτοικοι Αθηνών μέσου όρου ηλικίας 33.6 ± 1.5 ετών. Λήφθηκε πλήρες ιστορικό και διενεργήθηκε πλήρης βιοχημικός και αιματολογικός έλεγχος καθώς επίσης και ηλεκτροκαρδιογράφημα. Ακολουθήθηκε συγκεκριμένο πρωτόκολλο, το οποίο περιλάμβανε τη λήψη περιφερικού φλεβικού αίματος στις 8 προ μεσημβρίας, στη συνέχεια εγκλιματισμός των δειγμάτων για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και προσθήκη σταθεροποιητικών και καλλιεργητικών μέσων για τα κύτταρα. Κατόπιν μέρος των δειγμάτων επωάστηκε για τέσσερις ώρες σε θερμοκρασία 37o C σε περιβάλλον κορεσμένο σε 5% CO2 και προστέθηκε LPS σε δόση 500 ng/ml. Στη συνέχεια στα δείγματα προστέθηκε δοβουταμίνη ή νορεπινεφρίνη σε συγκεντρώσεις 10-4, 10-5 και 10-6 Μ και σε ορισμένα δείγματα προστέθηκε ο β1 αδρενεργικός αναστολέας μετοπρολόλη σε συγκέντρωση 10-5 Μ. Ακολούθησε φυγοκέντρηση (1800 rpm, 5 min). Κατόπιν συγκεντρώθηκε το υπερκείμενο υγρό, το οποίο αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία - 20o C. Η απελευθέρωση των κυτταροκινών εκτιμήθηκε με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA. Βρέθηκε ότι η χορηγηση δοβουταμίνης και νορεπινεφρίνης στη δόση που χορηγήσαμε (10-4Μ, 10-5Μ και 10-6Μ) μειώνουν σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (p<0.05) την απελευθέρωση TNF-α και IL-6 κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Συγκεκριμένα, η μεγαλύτερη καταστολή της απελευθέρωσης παρατηρείται στις μεγαλύτερες συγκεντρώσεις των κατεχολαμινών. Επίσης βρέθηκε ότι η χορήγηση β1 αδρενεργικού αναστολέα (μετοπρολόλης) στη δόση που χρησιμοποιήσαμε (10-5Μ) προκαλεί μερική αναστολή της μειωμένης παραγωγής των προφλεγμονωδών κυτταροκινών, οπότε το φαινόμενο συσχετίστηκε με β1 αδρενεργικό μηχανισμό δράσης. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στην επίδραση των δύο ουσιών Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση του αριθμού των υποδοχέων μετά από την επίδραση με δοβουταμίνη και νορεπινεφρίνη στις συγκεντρώσεις που χορηγήσαμε (10-4, 10-5 και 10-6 Μ). Συμπερασματικά, από την παρούσα μελέτη προκύπτει ότι η χορήγηση των κατεχολαμινών δοβουταμίνη και νορεπινεφρίνη μειώνει την απελευθέρωση των TNF-α και IL-6 (προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες) μετά από ex vivo διέγερση ολικού αίματος με LPS. Η επίδραση αυτή αναστρέφεται με τη χορήγηση του β1 αδρενεργικού αναστολέα μετοπρολόλη.