Οξειδωτική αναδίπλωση πρωτεϊνών στο διαμεμβρανικό χώρο μιτοχονδρίων σακχαρομύκητα

Abstract

The intermembrane space of mitochondria (IMS) harbours a dedicated machinery that promotes the oxidative folding of substrate proteins. The newly identified oxidative pathway consists of the redox-regulated receptor Mia40 and the sulfhydryl oxidase Erv1. Precursors destined to the IMS are trapped by a disulfide relay mechanism which involves an electron cascade from the incoming substrate to Mia40, then on to Erv1 and finally to molecular oxygen via cytochrome c. This thiol-disulfide exchange mechanism is essential for the import and oxidative folding of the incoming cysteinerich proteins. In this work we aim to elucidate the mechanistic parameters that define the interaction between the substrate and the oxidase Mia40. Biochemical analysis reveals a general mechanism whereby Mia40 transfers oxidising equivalents to the substrates via an Nterminal CPC motif. Structural analysis uncovered a hydrophobic cleft in the vicinity of the active site of Mia40 that is used as a substrate binding domain. Furthermore, in organello import experiments have revealed a site-specific mechanism for the cysteine dependent interaction of Mia40 with the incoming substrate. A unique cysteine is responsible for docking the protein onto Mia40 that differs depending on the substrate. We further identify the signal responsible for targeting the precursors to the IMS. Finally we show that this signal directs the docking cysteine of the substrate in the vicinity of the catalytic center of Mia40 via hydrophobic interactions. The present results are an important step towards revealing the full molecular details underlying the oxidative protein folding pathway in mitochondria.

Στον διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων εντοπίζεται ένας πρόσφατα αναγνωρισμένος μηχανισμός που προάγει την οξειδωτική αναδίπλωση νέο- εισερχόμενων πρωτεϊνικών υποστρωμάτων. Το οξειδωτικό μονοπάτι αποτελείται από τον οξειδοαναγωγικά ελεγχόμενο υποδοχέα Mia40 και την σουλφυδριλοξειδάση Erv1. Οι πρωτεΐνες που προορίζονται στον διαμεμβρανικό χώρο παγιδεύονται σε αυτόν με ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει κίνηση ηλεκτρονίων από το νέο- εισερχόμενο υπόστρωμα, στην Mia40, από εκεί στην Erv1 και τελικά στο οξυγόνο μέσω του κυτοχρώματος c. Η ανταλλαγή δισουλφιδικών δεσμών είναι ζωτικής σημασίας για την είσοδο και αναδίπλωση των πρωτεϊνών στον διαμεμβρανικό χώρο. Σε αυτή την μελέτη στοχεύουμε στην διερεύνηση των μηχανιστικών παραμέτρων που ορίζουν την αλληλεπίδραση των υποστρωμάτων με την οξειδάση του διαμεμβρανικού χώρου Mia40. Με βιοχημικά πειράματα δείχνουμε ότι η οξείδωση των υποστρωμάτων εξαρτάται από το αμινοτελικό CPC μοτίβο της Mia40. Παράλληλα χαρακτηρίζουμε δομικά την πρωτεΐνη και εντοπίζουμε μια υδρόφοβη κοιλότητα σε γειτνίαση με το καταλυτικό κέντρο της πρωτεΐνης που δρα ως περιοχή πρόσδεσης του υποστρώματος. Επιπλέον με την δημιουργία σημειακών μεταλλαγών στα υποστρώματα αποκαλύπτουμε ότι ανάλογα με το υπόστρωμα υπάρχει μια κυστεΐνη που είναι υπεύθυνη για την δισουλφιδική πρόσδεση στην Mia40. Τέλος προσδιορίζουμε την αλληλουχία που καθοδηγεί το υπόστρωμα στον διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων και συγκεκριμένα στο καταλυτικό κέντρο της Mia40 μέσω υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης στοιχειοθετούν ένα σημαντικό πλαίσιο για την περαιτέρω διερεύνηση του μοριακού οξειδωτικού μηχανισμού στα μιτοχόνδρια.