Ανάλυση του φυσιολογικού ρόλου των οξειδασών των πολυαμινών σε άγριου τύπου και γενετικά τροποποιημένα φυτά καπνού (Nicotiana tabacum L.) και arabidopsis (Arabidopsis thaliana)

Abstract

Polyamine oxidases (PAOs) are enzymes that catalyze the oxidative deamination of higher polyamines (PAs), producing hydrogen peroxide (H2O2) and aldehydes. H2O2 possesses signaling roles, inducing either defence responses or cell destruction. In order to reveal the signaling role and the physiological role of the produced H2O2 from the apoplastic PAO, transgenic tobacco plants were contructed, either overexpressing (S-PAO) or downregulating (A-PAO) a pao gene from maize. Transgenic plants showed decreased and increased PAs respectively, of the higher PAs Spermidine (Spd) and Spermine (Spm). Nevertheless, they do not exhibit significant alteration of the titers of the produced H2O2 in comparison with WT plants in normal growth conditions. The previous is attributed to the induction of the antioxidant machinery, specifically in the transgenic S-PAO cells. On the contrary, when stressed S-PAO plants, cannot tolerate the increased H2O2, thus inducing instead of additional responses PCD. In high salt conditions, S-PAO plants were significantly more sensitive in comparison with the corresponding WT plants, whereas A-PAO plants were more tolerant. Moreover, the mechanism by which PAs act during stress was elucidated. Thus, it was found that PA biosynthesis in being induced in salt stress conditions and Spd is transferred to the apoplast were is oxidized producing H2O2, which ‘signature’ promotes either tolerance responses (WT and A-PAO; medium and low levels of H2O2) or the PCD syndrome (S-PAO; High H2O2 levels). Moreover, endogenous PAs seem to possess a significant role in these responses, since transgenic plants that suppress the samdc gene, which is involved in synthesis of higher PAs, were significantly more sensitive to salt stress, mimicking in that notion S-PAO plants. On the contrary, in biotic stress S-PAO plants were significantly more tolerant to bacteria, and oomycetes but not to viruses. The increased tolerance of these plants is due to two factors: To the induction of defense genes and to cell wall modifications found in these plants. Both of these alterations depend on the H2O2 produced in S-PAO plants. During infection H2O2 is produced in the apoplast from Spm oxidation. Thus, S-PAO plants post-infection accumulate significantly higher levels of H2O2. On the contrary, A-PAO plants are more sensitive to infection. Moreover, pao genes from Arabidopsis were also cloned and analyzed. Five genes were found that encode for proteins with domains found in PAO enzymes. These genes were expressed in heterologous systems and the five corresponding proteins were purified. Thus, four out of five (AtPAO1, AtPAO2, AtPAO3, AtPAO4, and AtPAO5) oxidize PAs, and more specifically Spd and Spm. In contrast to the previously characterized apoplastic PAOs, these genes are implicated to the interconversion of PAs, exhibiting strong resemblance to their mammalian counterparts. To elucidate the role of these genes, transgenic Arabidopsis plants overexpressing AtPAO1, AtPAO3 and AtPAO5 were constructed. The transgenic plants that overexpress AtPAO3 exhibited significantly increased Put. These plants showed increased osmotic tolerance, probably due to the increased levels of 3-aminopropanal that is produced by the increased AtPAO3 protein. 3-aminopropanal could be further converted to β-alanine-betaine which is a compatible osmolyte. Finally, the results presented here show that PA apoplastic oxidation confers sensitivity against abiotic stress and tolerance against biotic stress. On the other hand, non-apoplastic PA oxidation seems to have a more complicated role.

Οι οξειδάσες των πολυαμινών (PAOs) είναι ένζυμα που καταλύουν την οξειδωτική απαμίνωση των ανώτερων πολυαμινών (PAs), παράγοντας Η2Ο2 και αλδεΰδες. Το Η2Ο2 έχει σηματοδοτικό ρόλο, επάγοντας είτε αμυντικές αποκρίσεις ή την καταστροφή του κυττάρου. Προκειμένου να διευκρινιστεί ο σηματοδοτικός και ο φυσιολογικός ρόλος τoυ παραγόμενου H2O2, που παράγεται από το αποπλασματικό ένζυμο PAO, κατασκευάστηκαν γενετικά τροποποιημένα φυτά (ΓΤΦ) καπνού, που υπερεκφράζουν (S-pao) και υποεκφράζουν (A-pao) το γονίδιο pao από τον αραβόσιτο. Tα ΓΤΦ φυτά παρουσιάζουν μειωμένα και αυξημένα επίπεδα, αντίστοιχα, των ανώτερων PAs σπερμιδίνη (Spd) και σπερμίνη (Spm). Παρ’ όλα αυτά δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα του H2O2 σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου (WT) σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης. Το γεγονός αυτό οφείλεται σε επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων, που επιτελούν την αντιοξειδωτική άμυνα των κυττάρων, ώστε να αποσβεστεί το επί πλέον Η2Ο2, που παράγεται από την οξείδωση των PAs. Αντίθετα, υπό την επίδραση παραγόντων καταπόνησης, που επάγουν την παραγωγή του Η2Ο2, ο προ-επαγμένος αντιοξειδωτικός μηχανισμός στα ΓΤΦ S-paoδεν ήταν σε θέση να αποσβέσει το επί πλέον Η2Ο2, με αποτέλεσμα την επαγωγή του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (programmed cell death, PCD). ΄Ετσι, σε συνθήκες υψηλής αλατότητας τα S-pao φυτά ήταν σημαντικά πιο ευαίσθητα σε σχέση με το αντίστοιχα φυτά WT, ενώ αντίθετα τα A-pao φυτά, ήταν πιο ανθεκτικά. Ακόμη, διαλευκάνθηκε ο μηχανισμός δράσης των PAs κατά την καταπόνηση. ΄Ετσι βρέθηκε ότι επάγεται η βιοσύνθεση των PAs σε συνθήκες υψηλής αλατότητας και η Spd μεταφέρεται στον αποπλάστη, όπου οξειδώνεται από την PAO. Τα S-pao, κατά συνέπεια, οξειδώνουν γρηγορότερα την μεταφερόμενη στον αποπλάστη Spd και παράγουν μεγαλύτερες ποσότητες H2O2, σε αντίθεση με τα A-pao. Η παραγωγή Η2Ο2 έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή έκφρασης αμυντικών γονιδίων, των οποίων η επαγωγή εξαρτάται από τα επίπεδα του παραγόμενου Η2Ο2. Κατά συνέπεια, η υψηλή ποσότητα Η2Ο2 δεν επάγει τα αντίστοιχα γονίδια, των οποίων η επαγωγή απαιτεί μέτρια επίπεδα Η2Ο2 με αποτέλεσμα την επαγωγή του PCD στα S-pao φυτά. Συγχρόνως, οι ενδογενείς PAs παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναστολή του PCD, καθώς ΓΤΦ φυτά, που κατασκευάστηκαν και υποεκφράζουν το γονίδιο samdc που εμπλέκεται στη παραγωγή των ανώτερων PAs, ενώ παρουσιάζουν φυσιολογική οξείδωση στον αποπλάστη των PAs, ενεργοποιούν τον PCD, όπως και στην περίπτωση των S-pao φυτών. Αντίθετα, σε βιοτικές καταπονήσεις, τα ΓΤΦ S-pao παρουσιάζουν αυξημένη ανθεκτικότητα απέναντι στα βακτήρια, στους ωομύκητες αλλά όχι στους ιούς.