Συντονισμένη ρύθμιση της έκκρισης πρωτεϊνών από βακτηριακές μεμβράνες μέσω του IRA1 μοριακού διακόπτη της SecA ατράσης

Abstract

The cell constitutively synthesizes proteins. 30% of the proteome is extracytoplasmic rendering secretion as a basic process of the cell life. In Bacteria, the experimental system that we use in this thesis, exist a variety of secretory machines (translocases). Transocases with the expenditure of energy, either in the form of ATP or in the form of gradient of protons in the membrane, secretes proteins through the lipid bilayer towards the extracellular space. From all the above secretory machines, only Sec translocase is essential for life, since it secretes the majority of the exracytoplasmic proteins and that is why it is studied in more detail in this analysis. The basic core of Sec translocase consists of the SecYEG oligomeric pore-like structures in the membrane and the peripheral protein SecA. Although SecA is a processive enzyme “moving” along preprotein secreted substrates, it shares homology with nucleic acid helicases. More specifically it contains a helicase amino terminal catalytic core (N-domain) with two nonhomologous specificity domains protruding from it. While the N-domain performs almost all the chemistries of SecA (ATP binding and hydrolysis, binding of the Signal Petide of the substrate and binding to the membrane at SecYEG), the so called specificity domains help helicases acquire their specific role and in particular assign SecA its task in protein secretion. These are: the Substrate Specificity Domain, SSD, where the preprotein substrate is postulated to bind and the Carboxy terminal C-domain that we have found it regulates the ATPase activity of the N-catalytic domain. The C-domain, through direct binding to the N-catalytic domain, suppresses SecA ATPase when it stays in the cytoplasm and there’s no need for energy consumption. Respectively in the absence of a tight association between the N-/C-domains, SecA ATPase is activated without any binding from ligands, mimicking the SecA behaviour in the membrane during translocation, when ATP hydrolysis is needed for secretion to happen. The binding of the C-domain to the N-domain is attributed to the first C-domain substructure of the Scaffold Domain, SD, but we have found also that IRA1 (Intramolecular Regulator of ATP hydrolysis 1) a conserved Helix-Loup-Helix structure in the C-domain is required for its regulatory role. SecA with a short IRA1 deletion becomes a hyperactivated ATPase that is nevertheless incompetent for transocation. Trying to answer the unresolved question of energy conversion to mechanical work in helicases, that most probably involves cross-talk between the catalytic and specificity domains, we focused on IRA1 mechanism, that is expected to act as a molecular switch essential for coupling ATP hydrolysis to translocation work. A variety of biochemical data supported also by the recently solved structures of SecA from Bacillus.subtilis and Mycobacterium.tuberculosis, suggest that through direct or long range conformational communication with almost all SecA subdomains, IRA1 “senses” all the ligands of the translocation reaction. Consequently IRA1 transmits conformational changes to the N-catalytic domain, regulating its properties. We propose that IRA1 intramolecular regulation is exerted through lateral “oscillations” of IRA1 to and from the helix of the SD that binds directly to the catalytic domain. Through these “oscillations” IRA1 affects SD’s conformation and controlls its binding and release from the N-domain. Likewise intermolecular regulation of SecA by the preprotein substrates is expected to involve similar “oscillations” of IRA1 to and from the SSD since IRA1 is positioned between the SD and the SSD, and it’s the only physical link connecting them. Analogous H-L-H substructures in helicases in general, could potentially connect their specificity domains and couple catalysis to mechanical work.

Το κύτταρο είναι ένα εργοστάσιο παραγωγής πρωτεϊνικών μορίων. Το 30% των παραγόμενων πρωτεϊνών εντοπίζονται στον εξωκυτταροπλασματικό χώρο, διαδεικνύοντας την εκκριτική διαδικασία ως εντελώς απαραίτητη για την ζωή του κυττάρου. Στα βακτήρια, το πειραματικό σύστημα που χρησιμοποιείται στην παρούσα διατριβή για την μελέτη της διαδικασίας της έκκρισης, εντοπίζεται πληθώρα εκκριτικών μηχανών (μεταθετάσες). Οι μεταθετάσες με κατανάλωση ενέργειας από την υδρόλυση νουκλεοτιδίων ή από την βαθμίδωση του δυναμικού των πρωτονίων κατά μήκος της μεμβράνης, επιτελούν την μεταφορά των πρωτεϊνών διαμέσου της λιπιδικής διπλοστοιβάδας προς στο εξωτερικό του κυττάρου. Από τις παραπάνω εκκριτικές μηχανές μόνο η Sec, είναι απαραίτητη για την φυσιολογική λειτουργία του βακτηριακού κυττάρου, καθώς εκκρίνει τις περισσότερες πρωτεΐνες και γι’ αυτό μελετάται διεξοδικότερα στην παρούσα ανάλυση. Ο βασικός πυρήνας της Sec μεταθετάσης αποτελείται από τoυς ολιγομερείς SecYEG σχηματισμούς που μοιάζουν με πόρους στην μεμβράνη και την περιφερειακή πρωτεΐνη SecA. Μολονότι η SecA είναι ένα ένζυμο που ‘’μετακινείται’’ σταδιακά κατά μήκος των εκκρινόμενων πρωτεϊνικών υποστρωμάτων, παρουσιάζει ομολογία με τις ελικάσες των νουκλεϊκών οξέων. Πιο συγκεκριμένα περιλαμβάνει ένα αμινοτελικό καταλυτικό πυρήνα, που παρουσιάζει ομολογία με τον αντίστοιχο καταλυτικό πυρήνα των ελικασών (Ν-περιοχή), από τον οποίο εκβάλλουν δύο μη ομόλογες με τις ελικάσες περιοχές που συντελούν στην εξειδίκευση της πρωτεΐνης. Και ενώ η αμινοτελική περιοχή επιτελεί σχεδόν όλες τις χημικές δραστηριότητες της SecA (δέσμευση και υδρόλυση ΑΤΡ, δέσμευση του Πεπτιδίου Σηματοδότη του υποστρώματος και δέσμευση στην μεμβράνη στην θέση που εντοπίζεται το σύμπλοκο SecYEG), οι επονομαζόμενες περιοχές εξειδίκευσης, βοηθούν τις ελικάσες να αποκτήσουν τον συγκεκριμένο τους ρόλο και αναθέτουν συγκεκριμένα στην SecA πρωτεΐνη την δράση της στην διαδικασία έκκρισης των πρωτεϊνών μέσα από μεμβράνες. Αυτές είναι: η περιοχή εξειδίκευσης του υποστρώματος SSD (Substrate Specificity Domain), όπου προτείνεται ότι δεσμεύεται το υπόστρωμα και η καρβοξυτελική περιοχή (C-domain), που έχουμε διαπιστώσει ότι ρυθμίζει την δραστικότητα ΑΤΡάσης της Ν-περιοχής. Η C-περιοχή, μέσω απευθείας αλληλεπίδραση με την Ν-καταλυτική περιοχή, καταστέλλει την δραστικότητα ΑΤΡάσης της SecA όταν η τελευταία εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και δεν υπάρχει ανάγκη κατανάλωσης ενέργειας. Αντίστοιχα, η ΑΤΡάση της SecA ενεργοποιείται απουσία ισχυρής αλληλεπίδρασης μεταξύ των Ν-/C-περιοχών της χωρίς να πραγματοποιείται καμία δέσμευση από τα υποστρώματα της εκκριτικής διαδικασίας. Στην περίπτωση αυτή επιτυγχάνεται μίμηση της συμπεριφοράς της SecA στην μεμβράνη κατά την διάρκεια της έκκρισης των πρωτεϊνών, όταν τα επίπεδα υδρόλυσης του ΑΤΡ πρέπει να είναι αυξημένα. Η δέσμευση της C-περιοχής στην Ν-περιοχή αποδίδεται στην πρώτη υποπεριοχή της C-περιοχής, την περιοχή SD (Scaffold Domain). Έχουμε όμως επιπλέον διαπιστώσει ότι και η υποπεριοχή IRA1 (Intramolecular Regulator of ATP hydrolysis 1), μία συντηρημένη δομή έλικας-λούπας-έλικας στην C-περιοχή απαιτείται επίσης για την ρυθμιστική δράση της τελευταίας. Η SecA πρωτεΐνη με μία μικρή έλλειψη στην IRA1 υποπεριοχή μετατρέπεται σε υπερενεργοποιημένη ΑΤΡάση η οποία παρόλα αυτά είναι ανίκανη να συντελέσει στην διαδικασία έκκρισης των πρωτεϊνών. Στην προσπάθεια μας λοιπόν να προσεγγίσουμε το αναπάντητο ερώτημα της μετατροπής της χημικής ενέργειας σε μηχανικό έργο στις ελικάσες, που πιθανότατα περιλαμβάνει ενδοεπικοινωνία μεταξύ της καταλυτικής περιοχής και των περιοχών που τους προσδίδουν εξειδίκευση, εστιαστήκαμε στον μηχανισμό ανίχνευσης της λειτουργίας της IRA1 υποπεριοχής, που αναμένεται να αποτελεί τον απαραίτητο μοριακό διακόπτη που συνδέει την υδρόλυση του ΑΤΡ με την διαδικασία έκκρισης των πρωτεϊνών μέσα από μεμβράνες. Με μία ποικιλία βιοχημικών δεδομένων που, ενισχύονται και από την πρόσφατη κρυσταλλογραφική ανάλυση της SecA από τα βακτήρια Bacillus.subtilis και Mycobacterium.tuberculosis, διαπιστώνουμε ότι η IRA1 υποπεριοχή, διαμέσου απευθείας ή μεγάλου βεληνεκούς αλληλεπιδράσεων σχεδόν με όλες τις υποπεριοχές της SecA, ‘’αισθάνεται’’ τις αλλαγές στην διαμόρφωση αυτών των περιοχών από την δέσμευση των διαφόρων υποστρωμάτων της διαδικασίας της έκκρισης. Εν συνεχεία η IRA1 υποπεριοχή μεταδίδει αλλαγές στην διαμόρφωση της N-καταλυτικής περιοχής και ρυθμίζει έτσι τις χημικές της δραστικότητες. Προτείνουμε τελικά ότι η ενδομοριακή ρύθμιση της SecA από την IRA1-υποπεριοχή, εφαρμόζεται μέσω των πλευρικών ‘’ταλαντώσεων’’ της τελευταίας από και προς την έλικα της SD-περιοχής, η οποία και δεσμεύεται απευθείας στην Ν-καταλυτική περιοχή. Μέσω αυτών των ‘’ταλαντώσεων’’ η IRA1-υποπεριοχή επιδρά στην διαμόρφωση της SD-περιοχής και ρυθμίζει την δέσμευση και απελευθέρωση της από την Ν-περιοχή. Παρομοίως η διαμοριακή ρύθμιση της SecA από το εκκρινόμενο πρωτεϊνικό υπόστρωμα, κατά την εκκριτική διαδικασία, αναμένεται να περιλαμβάνει παρόμοιες ‘’ταλαντώσεις’’ της IRA1-υποπεριοχής από και προς την SSD-περιοχή. Και αυτό γιατί η IRA1-υποπεριοχή εντοπίζεται μεταξύ των SD και SSD περιοχών και είναι ο μοναδικός σύνδεσμος μεταξύ τους. Γενικότερα, ανάλογες δομές έλικας-λούπας-έλικας στις ελικάσες ενδέχεται να συνδέουν τις περιοχές εξειδίκευσης που παρουσιάζουν και να συσχετίζουν την καταλυτική τους δραστικότητα με το μηχανικό έργο που επιτελούν στα εξειδικευμένα υποστρώματα τους.