Μελέτη της ρύθμισης των γονιδίων του συμπλόκου μέγιστης ιστοσυμβατότητας τάξης Ι

Abstract

Proteins encoded by Major Histocompatibility Complex class I genes bind, transport and present oligopeptides to T lymphocytes, thus playing a crucial role in immune response against pathogens and neoplastic cells but, also, in graft rejection and in some immune disorders. Their expression level is regulated by external stimuli such as virus, mitogens and, most important, cytokines (TNFα, IFNα, β and γ). CIITA is the major regulatory factor of MHC class II genes. In the present study, we have shown that CIITA also plays an important role in MHC class I gene expression, since its overexpression leads to an increase of MHC class I and II molecules on the cell membrane. Our data shows that this increase is due to an transcriptional activation of MHC promoters which is followed by all processes necessary for the translation and presentation of these molecules on the cell surface. Class I superinduction by IFNγ and TNFα on HeLa and Κ562 cell lines suggest a compiled and cooperative action of these cytokines with CIITA. It seems that both cytokines act through a different mechanism than CIITA. In NT2 cells, CIITA is capable to induce class I gene transcription in higher levels than Retinoic acid (RA). The mechanisms of action of these two factors do not show any synergy, are completely independent, they seem not to use common factors and they act through distinct sequences, enhancer A and ICS-α-B elements respectively. According to our results, CIITA has a partial involvement in basal and IFNγ-induced class I activation. IFNγ action is mediated by ICS and, on the other hand, by a mechanism in which CIITA is directly involved. The latter is responsible for 50% of the IFNγ inducing capacity and shows an absolute requirement for α and B boxes. Analytically, our data suggest that IFNγ action on class I promoter is mediated by two distinct regions with equal contribution in the total inducer capacity: ICS element and region -121-116. Both require functional -111-105, α and B boxes. -111-105 sequence is a new element in class I regulation. We have shown that enhancer B is an important regulatory element in constitutive and inducible by IFNγ and CIITA expression and that NFY-A is a common binding factor to Y and B elements of MHC class I and II genes respectively. Thus, our result converge to the existence of a common activation pathway of MHC class I and II promoters, acting through CIITA, α-B and X-Y elements. In conclusion, MHC class I transcriptional regulation is mediated by two groups of proximal promoter elements : enhancer A, that mediates RA, TNFα and IFNγ action though a CIITA-independent mechanism, and enhancer B-ICS element that mediates IFNγ and CIITA action. We have demonstrated the important role of α box in H2-Kb promoter response to IFNγ and CIITA. We identified a Tre-like and a X2BF-like binding activity. We found that the former is a CREB/ATF1 heterodimer and the latter is a new member of X2-binding proteins that shows synergistic binding with CREB/ATF. In our system, as in MHC class II, RFX5 seems to require synergy for binding and its in vivo recruitment depend on CIITA presence. These findings are consistent with the general belief that MHC genes are regulated in transcriptional level and that CIITA is a master control gene for MHC and, also, for the factors required for their presentation on the cell membrane. Moreover, CIITA seems to stabilize other important factors such as RFX5, thus playing an important role in the complex formation that leads to the transcriptional regulation of MHC genes.

Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια του Μέγιστου Συμπλόκου Ιστοσυμβατότητας τάξης Ι και ΙΙ προσδένουν, μεταφέρουν και παρουσιάζουν ολιγοπεπτίδια στα Τ λεμφοκύτταρα παίζοντας καταλυτικό ρόλο στην ανοσοαπόκριση έναντι παθογόνων οργανισμών, κακοηθών κυττάρων αλλά και στην απόρριψη μοσχευμάτων και στην αιτιοπαθολογία ή/και στη διατήρηση κάποιων αυτοάνοσων ασθενειών. Τα βασικά επίπεδα έκφρασης τους υπόκεινται σε δυναμική ρύθμιση μετά από εξωγενή ερεθίσματα όπως ιϊκοί παράγοντες, μιτογόνα και κυρίως κυτοκίνες όπως ο TNFα και οι IFNα, β και γ. Ο CIITA είναι o κύριος ρυθμιστικός παράγοντας των γονιδίων τάξης ΙΙ. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι η πρωτεΐνη αυτή κατέχει βασικό ρόλο και στην έκφραση των γονιδίων τάξης Ι, καθώς η υπερέκφραση της είναι ικανή να αυξήσει την παρουσία των μορίων τάξης Ι και ΙΙ στην κυτταρική μεμβράνη. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η αύξηση αυτή οφείλεται σε μεταγραφική ενεργοποίηση των υποκινητών η οποία ακολουθείται από όλες τις απαραίτητες διαδικασίες που απαιτούνται για την μετάφραση και παρουσίαση των μορίων αυτών στην κυτταρική μεμβράνη. Η υπερεπαγωγική δράση της IFNγ και του TNFα στην παρουσία των μορίων τάξης Ι σε κύτταρα HeLa και Κ562 δείχνει συνδυασμένη δράση και συνεργατικότητα των κυτοκινών αυτών με τον παράγοντα CIITA. Φαίνεται ότι και οι δύο κυτοκίνες δρουν μέσω διαφορετικού μηχανισμού από αυτόν του CIITA. Στην περίπτωση της κυτταρικής σειράς ΝΤ2, ο CIITA είναι ικανός να επάγει μόνος του τη μεταγραφή των γονιδίων τάξης Ι και μάλιστα σε πολύ υψηλότερα επίπεδα από το Ρετινοϊκό Οξύ (RΟ). Οι μηχανισμοί δράσης των δύο αυτών επαγωγικών παραγόντων δεν παρουσιάζουν συνέργια, είναι εντελώς ανεξάρτητοι, δεν φαίνεται να χρησιμοποιούν κοινούς παράγοντες και δρουν μέσω διαφορετικών αλληλουχιών, τον ενισχυτή Α και τα στοιχείων ICS-α-Β αντίστοιχα. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, ο CIITA διαθέτει μερική συμμετοχή στη βασική και μετά IFNγ ενεργοποίηση των γονιδίων τάξης Ι. Η IFNγ χρησιμοποιεί, εκτός από το στοιχείο ICS του ενισχυτή Α και έναν μηχανισμό στον οποίο ο CIITA εμπλέκεται άμεσα και ευθύνεται για το 50% της επαγωγικής της δράσης. Στον μηχανισμό αυτόν τα στοιχεία α και Β κατέχουν βασικό ρόλο. Αναλυτικά, στον υποκινητή τάξης Ι η επίδραση της IFNγ διαμεσολαβείται από δύο διακριτές περιοχές με ίση συμμετοχή στη συνολική επαγωγική ικανότητα της κυτοκίνης: το στοιχείο ICS και την περιοχή -121-116. Και οι δύο περιοχές απαιτούν την ύπαρξη λειτουργικών -111-105, α και Β στοιχείων. Η αναγκαιότητα της περιοχής -111-105 αποτελεί νέο στοιχείο στη ρύθμιση των τάξης Ι. Αποδείξαμε επίσης ότι ο ενισχυτής Β αποτελεί σημαντικό ρυθμιστικό στοιχείο στη συστατική και επαγόμενη από IFNγ και CIITA έκφραση και ότι ένας κοινός παράγοντας που προσδένεται στο στοιχείο Υ και Β είναι ο NFY-A. Έτσι, τα αποτελέσματα μας συγκλίνουν στην υπόθεση ύπαρξης κοινού μονοπατιού ενεργοποίησης από τον CIITA που δρα μέσω των α-Β και Χ-Υ στοιχείων στους υποκινητές τάξης Ι και ΙΙ αντίστοιχα. Συμπερασματικά, η μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων τάξης Ι γίνεται μέσω δύο ενοτήτων στοιχείων του εγγύς υποκινητή : αφ’ ενός τον ενισχυτή Α μέσω του οποίου δρουν το RO, ο TNFα και η IFNγ μέσω μηχανισμών ανεξάρτητων από το CIITA και αφ΄ ετέρου τον ενισχυτή Β και το στοιχείο ICS μέσω των οποίων δρουν η IFNγ και ο CIITA. Αποδείξαμε εδώ το σημαντικό ρόλο του στοιχείου α στην απάντηση του υποκινητή τάξης Ι Η2-Κb σε IFNγ και CIITA. Εντοπίσαμε δύο τύπους ενεργοτήτων που προσδένονται στο στοιχείο αυτό: μία με Tre-like και μια με X2BF συμπεριφορά. Δείξαμε ότι η πρώτη ενεργότητα αποτελείται από ένα ετεροδιμερές CREB/ATF1 ενώ η δεύτερη είναι ένα νέο μέλος της ομάδας των πρωτεϊνών που προσδένονται στο Χ2 στοιχείο και η πρόσδεση της απαιτεί συνέργια με την πρώτη. Επίσης, παρατηρήσαμε ότι ο παράγοντας RFX5 φαίνεται να απαιτεί συνεργατική πρόσδεση όπως και στα τάξης ΙΙ και η στρατολόγηση του in vivo προαπαιτεί την παρουσία CIITA Όλες οι παραπάνω παρατηρήσεις είναι σύμφωνες με την επικρατούσα άποψη ότι η ρύθμιση της έκφρασης των μορίων ΜΣΙ γίνεται κατά κύριο λόγο σε μεταγραφικό επίπεδο και επαληθεύει το ρόλο του CIITA ως κύριου ρυθμιστικού παράγοντα (master control) στην έκφραση των πρωτεϊνών του ΜΣΙ και των μορίων που απαιτούνται για την παρουσίαση τους στην κυτταρική μεμβράνη. Επιπλέον, ο CIITA φαίνεται να έχει ενεργό ρόλο στη διαδικασία σχηματισμού του συμπλόκου που οδηγεί στη μεταγραφική ενεργοποίηση των γονιδίων τάξης σταθεροποιώντας άλλους απαραίτητους παράγοντες όπως ο RFX5.