Φαρμακολογικές και βιολογικές μελέτες αναλόγων επιτόπωντης βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης (MBP). Αλληλεπιδράσεις losartan και κανναβινοειδών μορίων στις μεμβράνες

Abstract

The aim of this dissertation was of twofold: First, to apply biological tests for novel synthetic peptide analogues against Multiple Sclerosis (MS) and second, to perform biophysical experiments for two classes of bioactive compounds in order to shed some light on their mechanism of action on the membrane level. Myelin is a lipoprotein that masks the nervous endings of Central Nervous System (CNS) neurons. It is involved in the transportation of stimuli from the brain to the various parts of the body. When myelin is damaged, the stimuli are delayed or interrupted, depending on the degree of destruction. The disability of message transportation of stimuli as nervous dysfunction, characterizes the illness that is known as Multiple Sclerosis (MS). MS is an inflammatory illness of CNS. What induces MS is yet to be discovered, but the immunogenic system is considered to be responsible. For this reason, the biological activity of two epitopes of the Myelins’ Basic Protein in Lewis rats, were studied namely MBP74-85 of guinea pig Myelin Basic Protein and MBP87-99. MBP74-85 is known to induce Experimental Autoimmune Encephalomyelitis-EAE in Lewis rats. The EAE constitutes a very well characterized experimental model for the study of MS in animals. MBP87-99 has direct relation with appearance of MS in humans. Based on these epitopes, synthetically modified linear and cyclic peptides were tested for their ability to induce of inhibit EAE in Lewis rats. The obtained results have shown that some peptides induced EAE (e.g. the linear peptide [Arg91, Ala96]MBP87-99), as well as other suspended the action when they are injected simultaneously (e.g. the cyclic peptide cyclo(87-99) [Arg91, Ala96]MBP87-99). Biological membranes are the outer part of cells. They present an exceptional interest in pharmacology, by modulating the entrance of molecules in cells. Pharmaceutical molecules in order to exert their biological activity must bind to the receptors. If they don’t have the proper stereoelectronic features they do not produce productive interactions. Certain classes of bioactive molecules are considered to enter the membrane core before act on the receptor. The entry of biologically active molecules in the membranes causes changes in their dynamic and thermal properties related to their topography and orientation. The perturbation of membrane bilayers in turn may related to the way bioactive molecules approach and interact with the receptor. The interactions of two cannabinoids, Δ8-THC (psychotropic molecule) and Me-Δ8-THC (almost without activity molecule) with phospholipid bilayers containing cholesterol, as well as AT1-antagonist losartan in dipalmitoylphosphatidylcholine bilayers have been studied. The experiments were conducted using Differential Scanning Calorimetry and solid state 13C/MAS NMR. The two cannabinoids were found to enter the bilayer, influencing thermal and dynamic properties of DPPC bilayers with different way. The pharmacologically active one perturbs significantly more the phospholipid bilayers than the almost inactive one. Regarding losartan, it was found to enter the phospholipid bilayers in the mesophase where it perturbs the membrane packing through amphipathic interactions as it is depicted from solid state T1 relaxation time and Differential Scanning Calorimetry experiments.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποτελείται από δύο τμήματα. Στο πρώτο περιγράφονται βιολογικές δοκιμές σε νεοσυντεθέντα γραμμικά και κυκλικά πεπτιδικά ανάλογα των επιτόπων 74-85 της Βασικής πρωτείνης της Μυελίνης επίμυου και του επιτόπου 87-99 της Βασικής πρωτείνης της Μυελίνης ανθρώπου. Στο δεύτερο αναλύονται οι βιοφυσικές μελέτες δύο τάξεων βιοδραστικών μορίων για την κατανόηση του μηχανισμού δράσης τους σε επίπεδο μεμβρανών. Η μυελίνη είναι μία λιποπρωτείνη που καλύπτει τις νευρικές απολήξεις των νευρώνων του ΚΝΣ. Εμπλέκεται στη μεταφορά ερεθισμάτων από τον εγκέφαλο στα διάφορα μέρη του οργανισμού. Όταν η μυελίνη καταστρέφεται τα ερεθίσματα καθυστερούν ή διακόπτονται ανάλογα με το βαθμό καταστροφής της μυελίνης. Η ανικανότητα μεταφοράς ερεθισμάτων ως νευρική δυσλειτουργία χαρακτηρίζει την ασθένεια που είναι γνωστή ως Σκλήρυνση κατά Πλάκας-ΣΚΠ. Η ΣΚΠ είναι μία φλεγμονώδης ασθένεια του ΚΝΣ. Τα αίτια που την προκαλούν δεν είναι πλήρως γνωστά. Υπεύθυνο για την ασθένεια έχει θεωρηθεί το ανοσοποιητικό σύστημα. Για το λόγο αυτό μελετήθηκαν ο επίτοπος 74-85 της Βασικής πρωτείνης της Μυελίνης επίμυου και ο επίτοπος 87-99 της Βασικής πρωτείνης της Μυελίνης ανθρώπου. Ο επίτοπος 74-85 είναι γνωστό από τα βιβλιογραφικά δεδομένα ότι επάγει την Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα (ΕΑΕ) σε επίμυες Lewis. Η ΕΑΕ αποτελεί το πιο καλά χαρακτηρισμένο πειραματικό μοντέλο για τη μελέτη της ΣΚΠ σε ζώα. Ο επίτοπος 87-99 έχει άμεση σχέση με την εμφάνιση ΣΚΠ σε ανθρώπους. Γραμμικά και κυκλικά παράγωγα των δύο αυτών επιτόπων δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανοτητα τους να προκαλούν ή να αναστέλλουν την ΕΑΕ στους επίμυες. Από τις πειραματικές μελέτες προέκυψαν ότι κάποια συνθετικά πεπτίδια επάγουν την ΕΑΕ και κάποια άλλα αναστέλλουν την δράση του επιτόπου όταν χορηγούνται ταυτόχρονα. Σημαντική είναι η βιολογική δράση του τροποποιημένου πεπτιδίου cyclo(87-99) [Arg91, Ala96]MBP87-99 που αναστέλλει την ΕΑΕ όταν χορηγείται πριν ή μετά την χορήγηση του επιτόπου 74-85 που επάγει την ΕΑΕ. Οι βιολογικές μεμβράνες αποτελούν το εξωτερικό περίβλημα των κυττάρων (πλασματική μεμβράνη). Από πλευράς φαρμακολογίας παρουσιάζουν εξαιρετικό ενδιαφέρον. Αυτές καθορίζουν την είσοδο των φαρμακευτικών μορίων στο κύτταρο. Τα φαρμακευτικά μόρια για να εξασκήσουν τη βιολογική τους δράση τους πρέπει να προσδεθούν στους υποδοχείς τους. Όταν αυτοί βρίσκονται στο εσωτερικό του κυττάρου ή είναι διαμεμβρανικοί, τα φαρμακευτικά μόρια πρέπει να διαπεράσουν ή να διαχυθούν στις μεμβρανικές λιποειδείς διπλοστιβάδες για να τους προσεγγίσουν και να προσδεθούν σε αυτούς ώστε να επάγουν τη βιολογική τους δράση. Η αλληλεπίδραση βιοδραστικού μορίου με τον υποδοχέα προϋποθέτει ότι η χημική του δομή περιέχει τα κατάλληλα στερεοηλεκτρονικά χαρακτηριστικά εισδοχής, διάχυσης και πρόσδεσης. Η είσοδος βιολογικά δραστικών μορίων σε μεμβράνες προκαλεί μεταβολή στις δυναμικές και θερμικές ιδιότητες τους. Ο τρόπος που το δραστικό μόριο εισδύει, διευθετείται και προσανατολίζεται σε αυτές έχει μεγάλη σημασία για την δράση που θα ασκήσει τελικά στον οργανισμό. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του ζεύγους των κανναβινοειδών μορίων Δ8-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ8-THC) και του μεθυλαιθέρα της (Me-Δ8-THC) σε διπλοστιβάδες διπαλμιτικής φωσφατιδυλοχολίνης (DPPC) παρουσία χοληστερόλης. Επίσης μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις του losartan σε λιποειδείς διπλοστιβάδες διπαλμιτικής φωσφατιδυλοχολίνης. Οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν με συνδυασμό χρήσης της Διαφορικής θερμιδομετρίας Σάρωσης-DSC και του Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού-NMR σε στερεή φάση με περιστροφή του δείγματος υπό μαγική γωνία. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη έδειξαν ότι τα δύο κανναβινοειδή μόρια εισέρχονται στις διπλοστιβάδες επηρεάζοντας τις θερμικές και δυναμικές ιδιότητες της DPPC/χοληστερόλης με διαφορετικό τρόπο. Το βιοδραστικό ψυχότροπο κανναβινοειδές Δ8-THC προκαλεί πιο έντονες αλλαγές στις ιδιότητες της αυτές σε σχέση με το μη δραστικό Me-Δ8-THC. Όσον αφορά το losartan, ο ΑΤ1 ανταγωνιστής εισέρχεται στις μεμβρανικές διπλοστιβάδες μεταβάλοντας τις θερμικές και δυναμικές ιδιότητες των λιπιδικών διπλοστιβάδων. Η τοπογραφία του ανάμεσα στα φωσφολιπίδια των μεμβρανών μελετήθηκε με πειράματα χρόνου εφησυχασμού-Τ1. Αυτά έδειξαν ότι το losartan εντοπίζεται στο ενδιάμεσο τμημα πολικότητας των μεμβρανών όπου ευνοείται από αμφοτερικές αλληλεπιδράσεις.