Μolecular and endocrine regulation of the stress response during early developmental stages in european sea bass (Dicentrarchus labrax)

Abstract

The aims of this dissertation were to study the ontogeny of the endocrine stress response, to characterize the molecular programming of the Hypothalamus-Pituitary-Interrenal (HPI) axis, and to determine the impact of long term chronic mild stress applied early in life on the performance of fish at subsequent stages of development, in a Mediterranean marine teleost, the European sea bass (Dicentrarchus labrax). Sea bass embryos, pre-larvae and larvae at specific points of development were exposed to acute stressors and the temporal patterns of cortisol and α-MSH whole body concentrations and the expression of genes involved in corticosteroid biosynthesis, degradation and both cortisol and α-MSH signaling were determined. Expression of genes involved into the corticoid response regulation (gr1, gr2, mr, crf) combined with histological data indicated that, although a cortisol stress response is evident for the first time around first feeding, a pattern becomes progressively established in larvae at flexion until the formation of all fins. Moreover, mRNA transcript levels of 11β-hydroxylase and 11β-hsd2 which are involved in cortisol synthesis and deactivation/metabolism, respectively, showed a strong correlation with the whole body cortisol concentrations. An α-MSH stress response, an additional to cortisol pathway regulating stress in teleosts, is evident for the first time in the early development of European sea bass at the stage of mouth opening showing a specific pattern characterized by elevated levels that becomes established around the formation of all fins. mRNA transcript levels of pomc and mc2r were altered after the acute stress application in a consistent elevated pattern especially as development proceeds, at the stages of flexion and after the formation of all fins, showing at the same time a similar pattern with the whole body α-MSH concentrations. The acute stress application had no effect on the expression of mc1r but in the case of mc4r resulted in an increased transcription even as early as at the stage of mouth opening.In fish, stress research is focused on the effects of acute or chronic severe noxius stimuli of physical, chemical and husbandry nature applied in juveniles or adult individuals, and there is no information on the effects of early exposure to long term chronic mild stressors on the development and performance of fish at subsequent phases of the life-cycle, but also no valid chronic low intensity stress protocol exists for fish at early development. To this end an unpredictable chronic low intensity stress (UCLIS) protocol was developed and evaluated for the first time in early development of E. sea bass. UCLIS protocol was based on the unpredictability, variety, frequency and moderate intensity of the applied stressors, providing a relatively realistic model of everyday aquaculture husbandry practices. The UCLIS application lasted for 14 consecutive days, starting at three different phases of early ontogeny (first feeding, flexion and development of all fins). Evaluation of the UCLIS protocol was performed through the determination of water-born cortisol concentrations of the larvae rearing tanks at regular intervals, recording of mortality and measurements of growth performance. In addition, its effects on subsequent developmental phases were evaluated by measurement of growth characteristics and by the determination of plasma cortisol in juvenile fish, prior and 1h after the application of an acute stressor. Our data show that European sea bass larvae are sensitive to mild husbandry stimuli with consequences even at subsequent phases of the life-cycle, with the stages of first feeding and all fins being the most critical, pointing out the necessity to reconsider common rearing practices. In particular, UCLIS application resulted in higher water cortisol release rates in all groups where the stress was applied compared to the controls, proving to be a reliable non-invasive indicator of stress even during early ontogeny. Performance of fish in terms of growth rate was also affected by application of the stress protocol, as larvae that had been exposed to UCLIS at the beginning of first feeding and the formation of all fins displayed worst performance than fish exposed to UCLIS at flexion and controls. Early life stress did not affect plasma cortisol levels of juveniles exposed to additional acute stressors. However, fish were very sensitive to common handling practices and in addition, significant higher plasma cortisol concentrations were found in juveniles exposed to UCLIS at the stages of first feeding and the formation of all fins, compared to the other two groups, in accordance with the differences observed in growth rates. Concluding, the data obtained from this study provide a better insight into the onset and regulation of the stress response in early development of E. sea bass and show for the first time that early life stress, in the form of common husbandry practices, has an impact both on larvae performance and also on later stages of the life-cycle in this species, as life history affected the growth performance and the stress response in juvenile fish.

Σκοπός αυτής της διατριβής ήταν η μελέτη της οντογένεσης της ενδοκρινικής απόκρισης στην καταπόνηση (stress), ο χαρακτηρισμός των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ρύθμιση του άξονα υποθαλάμου-υπόφυσης-επινεφρίδιων (HPI) και ο προσδιορισμός της επίδρασης του χρόνιου ήπιου στρες κατά τα πρώτα αναπτυξιακά στάδια της ζωής στην ανάπτυξη και την επίδοση των ψαριών σε μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια, χρησιμοποιώντας ως μοντέλο ένα μεσογειακό θαλάσσιο τελεόστεο ιχθύ, το ευρωπαϊκό λαβράκι (Dicentrarchus labrax). Έμβρυα, προ-νύμφες και νύμφες λαβρακιού σε συγκεκριμένα αναπτυξιακά στάδια εκτέθηκαν σε οξύ στρες και προσδιορίστηκαν τα χρονικά πρότυπα των συγκεντρώσεων της κορτιζόλης και της α-MSH του σώματος, καθώς επίσης και η έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση και την αποικοδόμηση των κορτικοστεροειδών καθώς και στη σηματοδότηση τόσο της κορτιζόλης όσο και της α-MSH. Η έκφραση των γονιδίων που συμμετέχουν στην ρύθμιση της κορτικοειδούς απόκρισης (gr1, gr2, mr, crf) σε συνδυασμό με ιστολογικά δεδομένα, υποδεικνύουν ότι παρόλο που η απόκριση της κορτιζόλης στο στρες είναι εμφανής για πρώτη φορά στο στάδιο του πρώτου ταΐσματος, το πρότυπο της απόκρισης εγκαθιδρύεται σταδιακά στις νύμφες που βρίσκονται στις φάσεις της κάμψης της νωτοχορδής και μέχρι το σχηματισμό όλων των πτερυγίων. Η απόκριση της α-MSH στο στρες, ένα πρόσθετο μονοπάτι ρύθμισης του στρες πέραν της κορτιζόλης, είναι εμφανής για πρώτη φορά στο στάδιο του ανοίγματος του στόματος, εμφανίζοντας ένα συγκεκριμένο πρότυπο που χαρακτηρίζεται από αυξημένα επίπεδα, το οποίο εγκαθιδρύεται σταδιακά γύρω στο σχηματισμό όλων των πτερυγίων. Τα επίπεδα των mRNA μεταγράφων των pomc και mc2r μεταβλήθηκαν από την εφαρμογή του οξέως στρες παρουσιάζοντας ένα συνεπές πρότυπο αυξημένων επιπέδων, ειδικά με την πορεία της ανάπτυξης από την κάμψη της νωτοχορδής μέχρι το σχηματισμό όλων των πτερυγίων, εμφανίζοντας επίσης παρόμοιο πρότυπο με αυτό της μεταβολής των συγκεντρώσεων της α-MSH του σώματος. Το οξύ στρες δεν είχε καμία επίδραση στα επίπεδα έκφρασης του mc1r, ενώ στην περίπτωση του mc4r είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων μεταγραφής ήδη από το στάδιο του ανοίγματος του στόματος.Στα ψάρια, η έρευνα του στρες είναι επικεντρωμένη στη μελέτη της επίδρασης οξέως ή χρόνιου επιβλαβούς ερεθίσματος σωματικής, χημικής ή διαχειριστικής φύσεως σε νεαρά ή ενήλικα άτομα, ενώ δεν υπάρχουν πληροφορίες για την επίδραση της πρώιμης έκθεσης σε ήπια χρόνια στρεσογόνα ερεθίσματα στην ανάπτυξη και επίδοση των ψαριών σε επόμενες φάσεις του κύκλου-ζωής, ενώ επίσης δεν επίσης δεν υπάρχει κάποιο έγκυρο πρωτόκολλο ήπιου χρόνιου στρες για την πρώιμη ανάπτυξη των ψαριών. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε και εκτιμήθηκε για πρώτη φορά στην πρώιμη ανάπτυξη του λαβρακιού, ένα πρωτόκολλο μη προβλέψιμου, χρόνιου και ήπιας έντασης στρες (UCLIS). Η εφαρμογή του UCLIS διήρκησε 14 συνεχόμενες ημέρες, ξεκινώντας σε τρεις διαφορετικές φάσεις της πρώιμης οντογένεσης (πρώτο τάισμα, κάμψη της νωτοχορδής και σχηματισμός όλων των πτερυγίων). Η αξιολόγηση του πρωτοκόλλου UCLIS βασίστηκε στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων της κορτιζόλης που απελευθερώνονταν στο νερό των νυμφικών δεξαμενών εκτροφής ανά τακτά χρονικά διαστήματα, στην καταγραφή της θνησιμότητας και της επίδοσης στην ανάπτυξη. Επιπρόσθετα, έγινε εκτίμηση της επίδραση του UCLIS σε μετέπειτα αναπτυξιακές φάσεις μέσω της καταγραφής των αναπτυξιακών χαρακτηριστικών και του προσδιορισμού της κορτιζόλης του πλάσματος σε νεαρά ψάρια, πριν και 30 λεπτά μετά την εφαρμογή ενός οξέως στρες. Τα δεδομένα δείχνουν ότι οι νύμφες του λαβρακιού είναι ευαίσθητες σε ήπια διαχειριστικά ερεθίσματα με συνέπειες ακόμα και σε μετέπειτα φάσεις του κύκλου ζωής, με τα στάδια του πρώτου ταΐσματος και της ανάπτυξης όλων των πτερυγίων να είναι τα πιο κρίσιμα, επισημαίνοντας της αναγκαιότητα αναθεώρησης των συνηθισμένων πρακτικών εκτροφής. Συγκεκριμένα, η εφαρμογή του UCLIS είχε σαν αποτέλεσμα τον υψηλότερο ρυθμό απελευθέρωσης της κορτιζόλης στο νερό σε όλες ομάδες που εφαρμόστηκε το στρες σε σύγκριση με τις ομάδες αναφοράς, αποδεικνύοντας ότι είναι ένας αξιόπιστος μη-επεμβατικός δείκτης του στρες ακόμη και κατά την πρώιμη οντογένεση. Επίσης, η εφαρμογή του πρωτοκόλλου στρες επηρέασε και την επίδοση των ψαριών, υπό την έννοια της του ρυθμού ανάπτυξης, καθώς οι νύμφες που είχαν εκτεθεί στο UCLIS στην αρχή των σταδίων του πρώτου ταΐσματος και του σχηματισμού όλων των πτερυγίων επέδειξαν χειρότερη επίδοση από τα ψάρια που είχαν εκτεθεί στο UCLIS στο στάδιο της κάμψης της νωτοχορδής και από τα ψάρια που άνηκαν στην ομάδα αναφοράς. Το στρες στα πρώιμα στάδια της ζωής δεν επηρέασε τα επίπεδα της κορτιζόλης του πλάσματος σε νεαρά ψάρια όταν αυτά εκτέθηκαν σε οξύ στρες. Παρόλα αυτά, τα ψάρια ήταν πολύ ευαίσθητα σε κοινές διαχειριστικές πρακτικές και επιπλέον, στα νεαρά ψάρια που είχαν εκτεθεί στο UCLIS στα στάδια του πρώτου ταΐσματος και του σχηματισμού όλων των πτερυγίων βρέθηκαν σημαντικά υψηλότερες συγκεντρώσεις της κορτιζόλης του πλάσματος σε σύγκριση με τις άλλες δύο ομάδες, σε συμφωνία με τις παρατηρούμενες διαφορές στους ρυθμούς ανάπτυξης. Καταλήγοντας, τα δεδομένα που προέκυψαν από αυτή τη μελέτη παρέχουν μια βαθύτερη γνώση σχετικά με την οντογένεση και τη ρύθμιση της απόκρισης στο στρες στα πρώτα αναπτυξιακά στάδια στο λαβράκι και αποδεικνύεται για πρώτη φορά ότι το στρες, υπό τη μορφή κοινών διαχειριστικών πρακτικών, κατά τα πρώιμα στάδια της ζωής έχει επίδραση τόσο στην αναπτυξιακή επίδοση των νυμφών όσο και σε μετέπειτα στάδια της ανάπτυξης σε αυτό το είδος, καθώς η «ιστορία» των ψαριών επηρέασε την ανάπτυξη και την απόκριση στην κορτιζόλη στο στάδιο των νεαρών ψαριών.