Συμβολή στην παθολογοανατομική μελέτη της δονακίωσης του λαβρακίου (Dicentrarchus labrax)

Abstract

In this study, juvenile seabass fish were experimentally infected by immersion with two bacterial strains of V. anguillarum, (Van1 and Van731) in three different experiments. Van1, a naturally occurring strain, harbours a 67kb pJM1-like plasmid, which we named pKTP. pKTP encodes the iron-sequestering system of this strain. Using the heat shock method we have also created the plasmidless-derivative strain of Van1 designated as Van731. Both strains identified by PCR detection of the amiB gene. The successful curing of the plasmid was confirmed with angR and angH gene-specific PCR. The ability of the strain to produce histamine was tested by ΗPLC. The first experimental infection aimed to study the Van1 kinetics. The presence of the bacteria in fish tissues was confirmed with 16rRNA FISH using the Vav3 and the EUB 338 probes. Histological and FISH analyses showed that skin was the route of V.anguillarum invasion. The bacteria were found in small aggregates in dermis, as early as 20 hours post infection. At the same time point small numbers of bacteria were seen in the spleen and peritoneum. 72 hours post infection the bacteria were found in all the fish organs examined. The second experimental infection was carried out in order to assess the mortality of fish infected with the strains Van1 and Van 731. The mortality was significantly lower in fish infected with the Van 731 strain indicating that the presence of thepKTP plasmid is particularly important for Van1 pathogenicity. The third experimental infection aimed to investigate the effect of the iron-binding bacterial system on the V.anguillarum ability to induce histopathological lesions. The skin, the spleen and the heart were the organ mostly affected. Less severe lesions were seen in the liver, the head and body kidney, the gills, the posterior intestine and the swim bladder, whereas the lesions were scarce and mild in the remaining organs. The lesions that were consistently found in the organs of fish infected with both strains included oedema, vessel dilatation, congestion, haemorrhage, necrosis and mild inflammatory cell infiltration. The qualitative and quantitative analysis of V.anguillarum-induced lesions showed that the genetically modified strain Van731 caused significantly less pathology in fish. Taken together the results of this study suggest that iron binding system is important but not essential for the pathogenesis of vibriosis of the seabass. Other pathogenetic factors, although less important than the iron-binding system, contribute in the pathogenesis of vibriosis.

Πραγματοποιήθηκαν τρεις πειραματικές μολύνσεις ιχθυδίων λαβρακιού, με εμβάπτιση, και χρησιμοποιήθηκαν δύο βακτηριδιακά στελέχη V. anguillarum, το Van1 και το Van731. Το Van1, φυσικό στέλεχος διαπιστώσαμε ότι διέθετε πλασμίδιο μεγέθους 67Kb, που ονομάσαμε pΚΤΡ. Το pΚΤΡ είναι πλασμίδιο όμοιο με το pJM1 και υπεύθυνο για την παραγωγή σιδηροφόρου μορίου από το στέλεχος. To Van731 είναι γενετικά τροποποιημένο στέλεχος που δημιουργήσαμε από το Van1 με θερμική καταπόνηση. To Van731 δεν διαθέτει το pΚΤΡ πλασμίδιο. Τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν με PCR, με τη χρήση του γονιδίου amiB. Η επιτυχής αφαίρεση του πλασμιδίου επιβεβαιώθηκε με PCR με τη χρήση των γονιδίων angR και angH. Η παραγωγή ισταμίνης από τα στελέχη επιβεβαιώθηκε με HPLC. Η πρώτη πειραματική μόλυνση πραγματοποιήθηκε για τη μελέτη της κινητικής του Van1. Ο έλεγχος της παρουσίας του βακτηριδίου στους ιστούς επιβεβαιώθηκε με FISH. Για τον υβριδισμό χρησιμοποιήθηκαν οι ιχνηθέτες Vav3 και Eub338. Από την πρώτη πειραματική μόλυνση προκύπτει, ότι πύλη εισόδου του βακτηριδίου στον οργανισμό του ψαριού αποτελεί το δέρμα. Το βακτηρίδιο εντοπίστηκε σε μικρά αθροίσματα στο χόριο του δέρματος στις 20 ώρες μετά τη μόλυνση και σχεδόν ταυτόχρονα στο σπλήνα και στο περιτόναιο. Στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση το βακτηρίδιο διαπιστώθηκε στο σύνολο των οργάνων που εξετάστηκαν. Η δεύτερη πειραματική μόλυνση πραγματοποιήθηκε για να ελεγχθεί η προκαλούμενη από τα στελέχη Van1 και Van731 θνησιμότητα. Η μέση θνησιμότητα υπολογίστηκε στο 87,5% και 2,5% αντίστοιχα, αποδεικνύοντας ότι οφείλεται σε σημαντικό βαθμό στο πλασμίδιο που το βακτηρίδιο διαθέτει. Η τρίτη πειραματική μόλυνση πραγματοποιήθηκε για να περιγραφούν οι ιστοπαθολογικές αλλοιώσεις της Δονακίωσης από V. anguillarum στο λαβράκι και να διερευνηθεί σε επίπεδο αλλοιώσεων ο ρόλος του συστήματος δέσμευσης σιδήρου. Σημαντικότερες αλλοιώσεις από το Van1 προκλήθηκαν στο δέρμα, το σπλήνα και την καρδιά, ηπιότερες στο ήπαρ, τον κεφαλικό και σωματικό νεφρό, τα βράγχια, το οπίσθιο έντερο και τη νηκτική κύστη, ενώ ελάχιστες ήταν οι αλλοιώσεις στα υπόλοιπα όργανα. Κυκλοφορικές διαταραχές όπως οιδήματα, διάταση και συμφόρηση αγγείων, και αιμορραγίες, νεκρώσεις και ήπια φλεγμονώδης αντίδραση χαρακτήρισαν την ιστοπαθολογική εικόνα της νόσου στα διάφορα όργανα. Οι αλλοιώσεις ήταν σημαντικά ηπιότερες στα ιχθύδια που μολύνθηκαν με το Van731. Το σύστημα δέσμευσης σιδήρου αποδεικνύεται σημαντικό για την εκδήλωση της παθογένειας της νόσου. Εντούτοις στην παθογένεια εμπλέκονται και άλλοι παθογενετικοί μηχανισμοί του βακτηριδίου.