Molecular dynamics and phase transitions in protein-water systems

Abstract

This PhD Thesis deals with the systematic investigation of molecular dynamics and phase transitions in the case of hydrated proteins and other biomolecules, in a wide range of hydration levels. The main goal is the study of the dynamical characteristics of the observed transitions in relation to the coupling of hydration water to the biomolecules. In long terms, the main goal is to explain biological function in physical terms.The hydrated systems studied in this thesis are: two globular proteins, bovine serum albumin (BSA) and lysozyme and two fibrous proteins, elastin and collagen. In addition to hydrated proteins, two structurally simpler biopolymers where chosen, in order to compare the results to the ones obtained for hydrated proteins as well as to literature results obtained on more simple synthetic polymers. In particular, these are, hydrated solid samples and aqueous solutions of casein peptone (a digest derivative of the protein casein), as well as hydrated solid hydrogels of hyaluronic acid (HA).The crystallization and melting events of water and the glass transition were studied through differential scanning calorimetry (DSC). Molecular mobility (α relaxation of the hydrated systems and secondary relaxations of water in the uncrystallized and/orcrystallized phase) was investigated in detail using two dielectric techniques, thermally stimulated depolarization currents (TSDC) and dielectric relaxation spectroscopy (DRS), in a wide frequency and temperature range. Additional information on the hydration properties of the samples was obtained by water equilibrium sorption measurements (ESI) at roomtemperature.The thermal glass transition in the hydrated systems was recorder by DSC. Depending on the system the glass transition was recorded in different temperature regions, while it could not be detected for hydrated collagen. In general, the glass transition shows a strong hydration dependence. The variation of the glass transition temperature and the heat capacity step with hydration level leads to the conclusion that the motion associated with the transition includes contributions from the uncrystallized water molecules in the mixtures as well as segments of the biopolymer.The dielectric response which is associated with the thermal glass transition was studied by DRS and TSDC. A relaxation which exhibits cooperative character, according to the temperature dependence of its dielectric strength, was recorded in quite good accordance with the results from calorimetry, in the case of less rigid systems. On the other hand, in the case of the fibrous protein elastin which exhibits a glass transition at higher temperatures than the rest of the systems, but also for the fibrous protein collagen, which does not exhibit a glass transition, a dielectric relaxation, similar to the dielectric manifestation of the glass transition previously mentioned for the rest of the systems, is still recorded. The striking result is that the relaxation in question is recorded in a specific temperature interval, independently of the calorimetric glass transition. It is suggested thatthe dielectric relaxation probes mainly the polarization of uncrystallized water molecules within clusters on the surface of the hydrated molecules.The main dielectric relaxation due to uncrystallized water molecules in the hydration shell of the hydrated systems was systematically studied. An interrelation of the latter to a secondary relaxation of polar groups on the surface of the hydrated systems was observed. In particular, the uncrystallized water molecules at low hydration levels trigger the motion of small polar groups on the surface of the biomolecules. The characteristic relaxation times are being reduced as the hydration level increases. The dynamical characteristics of the relaxation depend on the polar groups sequence and proportionality. In a critical region of hydration levels of about 20-30 wt% the surface of the biopolymer is gradually covered by water molecules and a percolative uncrystallized water cluster is formed, in parallel to the stabilization of both the relaxation time and the dielectric strength of the relaxation. In general, the relaxation is of secondary character and is well described by an Arrhenius lawat low temperatures. In the region where the characteristics of the relaxation stabilize, the dielectric response corresponds to a mode within the uncrystallized water layer which covers the underlying surface. The excess water molecules beyond the main uncrystallized water layer, are being organized into various uncrystallized or crystalline forms depending on the structure. Finally, there are implications for a transition of the uncrystallized water molecules from a high density amorphous form (HDA) to a low density amorphous form (LDA) at high temperatures, at least in the case of the globular protein BSA.

Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής είναι η παράλληλη μελέτη της μοριακής δυναμικής και των μεταπτώσεων φάσης πρωτεϊνών και βιοπολυμερών, σε ευρεία περιοχή επιπέδων υδάτωσης. Προσδοκώμενο τελικό αποτέλεσμα είναι, βραχυπρόθεσμα, η παραγωγή νέας γνώσης σε θέματα που αναφέρονται στην διαμόρφωση της δομής, της μοριακής δυναμικής και των μεταπτώσεων φάσης της πρωτεΐνης (ή του βιοπολυμερούς) και του διαλύτη ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασής τους, και, μακροπρόθεσμα, η συμβολή στη ποσοτική περιγραφή και κατανόηση βιολογικών λειτουργιών με όρους Φυσικής.Τα υδατωμένα συστήματα που μελετήθηκαν σε αυτή την διδακτορική διατριβή είναι: δύο σφαιρικές πρωτεΐνες, αλβουμίνη βοεΐου ορού (bovine serum albumin, BSA) και λυσοζύμη (lysozyme) και δύο ινώδεις πρωτεΐνες, ελαστίνη και κολλαγόνο. Εκτός από πρωτεΐνες, επιλέχθηκαν δύο δομικώς απλούστερα βιοπολυμερή, προκειμένου να γίνει σύγκριση των αποτελεσμάτων με τα αντίστοιχα που προκύπτουν για τις πρωτεΐνες, καθώς και με αντίστοιχα αποτελέσματα από τη μελέτη υδροπηκτωμάτων συνθετικών πολυμερών. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν ενυδατωμένα στερεά δοκίμια και υδατικά διαλύματα πεπτόνης της καζεΐνης (παράγωγο πέψης της πρωτεΐνης καζεΐνης) και ενυδατωμένα στερεά υδροπηκτώματα (hydrogels) υαλουρικού οξέος (hyaluronic acid, HA).Τα φαινόμενα κρυστάλλωσης και τήξης του νερού καθώς και το φαινόμενο της υαλώδους μετάβασης των μακρομορίων, μελετήθηκαν μέσω της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης (differential scanning calorimetry, DSC). H μοριακή δυναμική (οα μηχανισμός διηλεκτρικής αποκατάστασης των ενυδατωμένων συστημάτων και οι δευτερεύοντες μηχανισμοί των μορίων νερού στην μη κρυσταλλική και/ή κρυσταλλική φάση) μελετήθηκαν διεξοδικά μέσω δύο διηλεκτρικών τεχνικών, θερμικώς διηγερόμενα θερμορεύματα αποπόλωσης (thermally stimulated depolarization currents (TSDC)) και διηλεκτρική φασματοσκοπία εναλλασσομένου πεδίου (dielectric relaxation spectroscopy (DRS)), σε ευρεία περιοχή συχνοτήτων και θερμοκρασιών. Επιπλέον πληροφορίες για την οργάνωση των μορίων νερού κατά την υδάτωση προήλθαν από μετρήσεις ισόθερμης υδάτωσης σε ισορροπία (water equilibrium sorption measurements, ESI) σε θερμοκρασία περιβάλλοντος.Η θερμική υαλώδης μετάβαση στα ενυδατωμένα συστήματα καταγράφηκε με την τεχνική DSC. Ανάλογα με το προς μελέτη σύστημα, η υαλώδης μετάβαση εκδηλώνεται σε διαφορετική θερμοκρασιακή περιοχή ενώ στην περίπτωση του κολλαγόνου δεν είναι ανιχνεύσιμη. Ένα γενικό συμπέρασμα είναι ότι η υαλώδης μετάβαση εξαρτάται άμεσα από το επίπεδο υδάτωσης. Η μελέτη της μεταβολής της θερμοκρασίας υαλώδους μετάβασης και του βήματος θερμοχωρητικότητας με το επίπεδο υδάτωσης οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η μοριακή κίνηση που συσχετίζεται με το φαινόμενο περιέχει συνεισφορές από τα μη κρυσταλλωμένα μόρια νερού καθώς και από τμήματα των βιοπολυμερών.H διηλεκτρική απόκριση που σχετίζεται με τη θερμική υαλώδη μετάβαση μελετήθηκε με τις τεχνικές DRS και TSDC. Ένας μηχανισμός διηλεκτρικής αποκατάστασης που εμφανίζει χαρακτηριστικά συνεργασιμότητας, όπως προκύπτει από τη θερμοκρασιακή εξάρτηση της διηλεκτρικής ισχύος, καταγράφηκε σε αρκετά καλή συμφωνία με τα αποτελέσματα της θερμιδομετρίας, προκειμένου για τα πιο εύκαμπτα συστήματα. Αντιθέτως, στην περίπτωση της ινώδους πρωτεΐνης ελαστίνης η οποία παρουσιάζει την υαλώδη μετάβαση σε περιοχή υψηλότερων θερμοκρασιών σε σχέση με τα υπόλοιπα συστήματα, αλλά επίσης στην περίπτωση της ινώδους πρωτεΐνης κολλαγόνο, η οποία δεν εμφανίζει υαλώδη μετάβαση, καταγράφεται ένας μηχανισμός διηλεκτρικής αποκατάστασης ο οποίος είναι παρόμοιος με τον αντίστοιχο μηχανισμό που σχετίζεται με την υαλώδη μετάβαση, και καταγράφηκε για τα υπόλοιπα συστήματα. Το κύριο αποτέλεσμα είναι ότι ο εν λόγω μηχανισμός εκδηλώνεται σεσυγκεκριμένη θερμοκρασιακή περιοχή, ανεξάρτητα από την θερμική υαλώδη μετάβαση. Προτείνεται σχετικά, ότι ο μηχανισμός διηλεκτρικής αποκατάστασης εκφράζει κυρίως την πόλωση μη κρυσταλλωμένων μορίων νερού εντός συσσωματωμάτων στην επιφάνεια των ενυδατωμένων μορίων.Ο κύριος μηχανισμός διηλεκτρικής αποκατάστασης των μη κρυσταλλωμένων μορίων νερού στα διεπιφανειακά στρώματα των ενυδατωμένων συστημάτων μελετήθηκε διεξοδικά. Παρατηρήθηκε μια αλληλοσυσχέτιση αυτού με ένα δευτερεύοντα μηχανισμό πολικών ομάδων στην επιφάνεια των ενυδατωμένων συστημάτων. Συγκεκριμένα, τα μη κρυσταλλωμένα μόρια νερού σε χαμηλά ποσοστά υδάτωσης διεγείρουν την κίνηση μικρών πολικών ομάδων στην επιφάνεια των βιοπολυμερών. Οι χαρακτηριστικοί χρόνοι αποκατάστασης μειώνονται με την αύξηση του επιπέδου υδάτωσης. Τα δυναμικά χαρακτηριστικά του μηχανισμού εξαρτώνται από την διαδοχή και αναλογία των πολικών ομάδων στην επιφάνεια. Σε μία κρίσιμη περιοχή επιπέδων υδάτωσης περίπου ίση με 20 - 30% κ. β. η επιφάνεια του βιοπολυμερούς καλύπτεται σταδιακά από μη κρυσταλλωμένα μόρια νερού και δημιουργείται ένα συνεχές επιφανειακό στρώμα νερού, ενώ παράλληλα σταθεροποιούνται οι τιμές των χαρακτηριστικών χρόνων χαλάρωσης και της διηλεκτρικής ισχύος του μηχανισμού. Σε γενικές γραμμές ο μηχανισμός είναι δευτερεύων, τοπικού χαρακτήρα και περιγράφεται ικανοποιητικά από την εξίσωση Arrhenius σε χαμηλές θερμοκρασίες. Στην περιοχή όπου σταθεροποιούνται τα χαρακτηριστικά του μηχανισμού η διηλεκτρική απόκριση αντιστοιχεί στην χαλάρωση μέρους του επιφανειακού στρώματος μη κρυσταλλωμένων μορίων νερού που καλύπτουν την επιφάνεια του μορίου. Τα επιπλέον μόρια νερού που βρίσκονται εκτός του κύριου επιφανειακού στρώματος μη κρυσταλλωμένων μορίων νερού, οργανώνονται σε άλλες δομές στην κρυσταλλική ή μη φάση, ανάλογα με την μορφολογία. Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις για μετάβαση των μορίων νερού από μία άμορφη κατάσταση υψηλής πίεσης (high density amorphous, HDA) προς μία άμορφη κατάσταση χαμηλής πίεσης σε υψηλές θερμοκρασίες (low density amorphous, LDA), τουλάχιστον στην περίπτωση της σφαιρικής πρωτεΐνης BSA.